一种应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种应用通城虎叶 片进行快速繁殖的方法。
【背景技术】
[0002] 通城虎为马兜铃科植物，草质藤本，根圆柱形，细长，茎无毛，干后常有纵棱。又名 五虎通城、定心草、天然草、学萎、血藤暗消、一点血。性味苦、辛、温；小毒，具有祛风、镇痛、 消肿、解毒。主治风湿骨痛、胃脘痛、腹痛、咽喉炎、跌打损伤、小儿惊风、毒蛇咬伤。产于广 西（陆川、苍梧、昭平）、广东（博罗、德庆、阳春等）、江西（德兴）、浙江和福建，野生的通城 虎常生于山谷林下灌丛中和山地石隙中，生境要求较为严格，因此地域分布范围相当有限， 近年来随着市场需求量的不断增加，对野生资源的采集量逐渐增大，野生通城虎资源濒临 枯竭。利用组织培养快繁技术，可以有效快速的增加其繁殖系数，目前有关通城虎的组织培 养报道较少，尚未有采用叶片作为外植体培养的相关报道，因此本发明采用叶片为外植体， 不仅取材方便，而且节约了茎段避免了整株采集，有利于通城虎资源的保护，也能满足市场 对通城虎药材的需求。
【发明内容】
[0003] 作为各种广泛且细致的研宄和实验的结果，本发明的发明人已经发现，普通的MS 培养基和普通的植物组织培养条件根本不能满足通城虎植物组织培养的需要，因此，本发 明人在普通的MS培养基中添加了不同的植物激素或者营养成分以满足通城虎叶片植物组 织培养的营养需求，并对植物组织培养条件进行了针对性的改进以满足应用通城虎叶片快 速繁殖的要求。
[0004] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0005] 本发明还有一个目的是提供一种应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其能够实 现通城虎的快速繁殖，且能保证通城虎的品质及药用价值。
[0006] 本发明还有一个目的是为通城虎叶片进行快速繁殖提供各个阶段更适宜的培养 基配方以及培养条件，提高通城虎组织培养的效率，保证组织培养的试管苗的成活率，以在 最短时间内获得最多通城虎完整试管苗为目标。
[0007] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种应用通城虎叶片进行快 速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一、制备通城虎无菌外植体；
[0009] 步骤二、愈伤组织诱导：将无菌外植体去掉叶脉并切块处理后接种到诱导培养基 上进行诱导培养，获得愈伤组织，其中，所述诱导培养基中含有MS+6-BA 1. 0-1. 5mg/L+2， 4-D 2. 0-4. Omg/L+NAA 0. 5-1. 5mg/L ；
[0010] 步骤三、愈伤组织分化：将所述愈伤组织接种到分化培养基中获得丛生芽，其中， 所述分化培养基中含有MS+1. 0-2. Omg/L的TDZ ;
[0011] 步骤四、壮苗：将丛生芽接种到壮苗培养基中进行壮苗培养，获得试管苗，其中，所 述壮苗培养基中含有MS+6-BA 0? 1-0. 5mg/L+IBA 0? 1-0. 5mg/L和0? 5-1. 5g/L的粉状活性 炭；
[0012] 步骤五、生根：将试管苗移植入生根培养基中获得带根的试管苗，其中，生根培养 基中含有 1/2MS+IBA 0? 1-0. 5mg/L+NAA 0? 5-1. Omg/L 和 0? 1-0. 5g/L 的粉状活性炭；步骤 六、炼苗和移栽：炼苗后获得完整植株，然后将其移栽至基质中培养。
[0013] 在上述方案中，由于采用通城虎的叶片作为植物组织培养的无菌外植体，叶片与 茎段相比，节约了茎段避免了整株采集，有利于通城虎资源的保护，也能满足市场对通城虎 药材的需求；
[0014] 在本发明步骤五中提供出粉状活性炭适宜的添加浓度，不仅给试管苗生根提供一 个黑暗环境，而且还可吸附一定量的有害物质，但是，并不会吸附有利物质，不会降低试管 苗生根的营养物质的浓度。
[0015] 在上述方案中，为通城虎叶片植物组织培养的不同阶段提供不同的培养基，使通 城虎的无菌外植体在各种适宜的培养基的连续作用下，最大程度提高外植体的成苗率，达 到快速、有效和无损伤的繁殖通城虎的目的。
[0016] 优选的是，其中，所述诱导培养基中含有MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 3. Omg/ L+NAA 1.0mg/L ;所述分化培养基中含有MS+2.0mg/L的TDZ ;所述壮苗培养基中含有 MS+6-BA0. lmg/L+IBAO. 5mg/L和I. 5g/L的粉状活性炭；所述生根培养基中含有1/2MS+IBA 0? 5mg/L+NAA 0? 5mg/L 和 0? 5g/L 的粉状活性炭。
[0017] 优选的是，其中，所述诱导培养基中还含有5-10mL/L的通城虎叶片提取液；所述 壮苗培养基中还含有15_20mL/L的通城虎叶片提取液。
[0018] 优选的是，其中，所述通城虎叶片提取液为将通城虎成熟叶片搅碎获得的汁液。
[0019] 优选的是，其中，所述步骤六中所述基质由体积比为5~3 : 3~2 : 1的腐殖土、 干苔藓和珍珠岩组成。
[0020] 在上述方案中，干苔藓在使用过程中首先被人工粉碎成40-60目的颗粒物，之后 将腐殖土、干苔藓和珍珠岩按比例混合后，在常温下放置5-7d，每天喷一次水同时进行一次 常规搅拌，喷水量为50-100ml/kg基质，之后成为培养完整试管苗的基质，其中，本发明所 述基质能为试管苗提供必要的营养，使通城虎试管苗生长良好，成活率高。
[0021] 野生的通城虎常生于山谷林下灌丛中和山地石隙中，生境要求较为严格，苔藓多 出现在通城虎的生长环境中，为通城虎的生长和攀爬提供一定的营养，并改善其生长的土 壤环境，本发明所提供的基质中添加一定的干苔藓并在使用前做一些前期处理，使干苔藓 中的营养成分更好的溶出在腐殖土中，为通城虎的试管苗的生长提供更接近于自然的生长 环境，使得通城虎的试管苗生长旺盛，提高成活率，以及更好的保持野生通城虎的营养组 成，保持它的药用价值。
[0022] 优选的是，其中，所述步骤六中所述基质由体积比为4 : 2 : 1的腐殖土、干苔藓 和珍珠岩组成。
[0023] 优选的是，其中，所述步骤一中应用通城虎茎尖顶端的幼嫩叶片制备所述通城虎 无菌外植体。
[0024] 优选的是，其中，所述诱导培养基、所述分化培养基、所述壮苗培养基和所述生根 培养基中均含有4. 5g/L的琼脂和25g/L蔗糖，且pH值均为5. 8。
[0025] 优选的是，其中，所述步骤四还包括以下步骤：将所述试管苗接种于继代培养基中 进行继代培养，其中，所述继代培养基中含有MS+KT 0? 1-0. 5mg/L+6-BA 0? 2-1. Omg/L+NAA 0. 2-1. 0mg/L、4. 5g/L的琼脂和25g/L蔗糖，培养条件为：温度24-26°C，光照强度20001ux， 继代培养基的pH值为5. 8。
[0026] 在上述方案中，将试管苗接种于继代培养基中进行继代培养，在保证通城虎品质 的同时适应大规模生产的需要。
[0027] 优选的是，其中，所述步骤一中还包括外植体选择和外植体的消毒，其中，外植体 的选择的具体过程为：取靠近通城虎茎尖顶端的幼嫩叶片，自来水中浸泡30min，然后用 毛细刷在流水下轻轻刷洗叶片表面及背面，然后摊开在吸水纸上，自然风干；外植体的消 毒的具体过程为：将自然风干后的叶片用1%洗洁精水溶液浸泡5-10min，线状自来水冲 洗10-15min，在接种室超净台上用经高压灭菌的无菌水润洗一次，然后用75%的酒精浸泡 30-50s，再用添加了 2-3滴吐温-20的150ml体积分数为0. 1%升汞消毒4-6min，无菌水冲 洗3-5次，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分，得到无菌外植体；
[0028] 所述步骤二中愈伤组织诱导的具体过程为：将无菌外植体去掉叶脉组织，切成 1. 0-2. Ocm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，然后接种到所述诱导培养基中，在培养温度为 24- 26°C，在暗培养条件下培养7d，然后在光照强度15001ux，光照时间为10-12h/d的条件 下培养21d，获得嫩绿色的愈伤组织；
[0029] 所述步骤三中愈伤组织分化的具体过程为：将所述愈伤组织，切成2. Ocm的正方 形叶块，接种到所述分化培养基中，在培养温度为24-26°C，光照强度15001UX，光照时间为 10-12h/d的条件下培养21d，获得丛生芽；
[0030] 所述步骤四中壮苗培养具体过程为：将所述丛生芽置于所述壮苗培养基中，在培 养温度24-26°C，光照强度20001UX，光照时间为10-12