玉米根虫和其他昆虫害虫的管理的制作方法

文档序号:8490698阅读:329来源:国知局
玉米根虫和其他昆虫害虫的管理的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月20日提交的美国临时申请第61/703,396号;2013年3 月14日提交的美国临时申请第61/781,057号;2012年9月20日提交的美国临时申请第 61/703, 414号;2013年3月14日提交的美国临时申请第61/781,124号;以及2013年3月 14日提交的美国临时申请第61/782, 116号的权益,所述临时申请的全部内容以引用方式 并入本文。
[0003]序列表的引用
[0004] 序列表作为于2013年9月20日创建的名为"BB2191PCT_Sequence_Listing"的 文本文件于2013年9月20日提交,大小为167, 238字节,根据37C.F.R. § 1. 52 (e) (5)以 引用方式将其并入本文。
技术领域
[0005]
技术领域涉及包括具有提高的对一种或更多种昆虫害虫植食性(herbivory)的 易感性的植物的诱虫作物和/或庇护作物,以及它们作为昆虫害虫管理计划的一部分的用 途。
【背景技术】
[0006] 昆虫、线虫和相关的节肢动物每年在美国估计破坏15%的农作物,在发展中国家 破坏的比例更高。这种损害有些是在植物病原体、昆虫和其他此类土生(soilborne)害 虫在种子种植后攻击种子时在土壤中发生的。例如在玉米的生产中,这种损害的其余部分 中有很多是由根虫(以取食或者以别的方式损害植物根的昆虫害虫)、由切根虫、欧洲玉米 螟(ECB)以及由取食或者损害植物的地上部分的其他害虫引起的。有关害虫对农作物的攻 击的类型和机制的一般描述由例如以下文献提供:Metcalf,1962年,《破坏性昆虫和有益昆 虫:它们的习性和防控(第四版)》(DestructiveandUsefulInsects:TheirHabitsand Control)FourthEdition),(更早的版本由C.L.Metcalf和W.P.Flint编著),麦格劳-希 尔图书公司(McGraw-HillBookCompany),纽约,三藩市、多伦多、伦敦;以及Agrios,1988 年,《植物病理学(第三版)》(PlantPathology,3rdEd.),学术出版社(AcademicPress)。
[0007] 在北美,传统上,轮作和使用杀虫剂是针对以下害虫的主要管理策略:玉米根虫 [西部玉米根虫(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)、北部玉米根虫(Diabrotica barberiSmith和DiabroticabarberiLawrence)以及南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctatahowardiBarber)]。但是,西部玉米根虫(WCR)的生物变型(biotype)适 应而优先在大豆植物上产卵、北部玉米根虫(NCR)的生物变型适应而导致卵的滞育延长、 玉米根虫对土壤杀虫剂和叶面杀虫剂的逆抗性以及人们对连作玉米的不断增加的需求,已 导致了近年来这种昆虫害虫的分布区显著扩大。能防护根虫的转基因杀虫性杂交玉米(Bt) 的市场供应提供了一种有效的替代方案,结果导致用于防控WCR的转基因玉米的种植面积 快速增加。针对Bt杀虫蛋白的广泛使用,需要考虑昆虫抗性管理方法。对于其他昆虫害虫 如欧洲玉米螟的防控计划,存在类似的问题和关注。
[0008] 对于另外的防控方法存在着需求,所述另外的防控方法可与其他方法或者过程联 合使用,以便得到成本效益性好且具有可持续性的昆虫害虫管理方案。对于降低昆虫害虫 发展对Bt毒素的抗性的可能性的方法也存在着需求。

【发明内容】

[0009] 本文提供了由于Crwl和/或Crw2的内源表达的降低而对昆虫害虫植食性的易感 性提高的植物。还提供了制备这种植物的方法。所述植物可为玉蜀黍(maize)、大豆、向日 葵、高粱、卡诺拉油菜(kanola)、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米或者甘蔗。玉蜀黍尤其值 得关注。昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。玉米(corn)根虫、欧洲玉米螟、日本金龟 子、秋幕毛虫和香蒲毛虫特别值得关注。
[0010] 还提供了包括这种植物的诱虫作物。诱虫作物可由选自以下的植物构成:玉蜀黍、 大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米和甘鹿。玉蜀黍特别值 得关注。
[0011] 提供了使用诱虫作物来防控一种或更多种昆虫害虫的方法。
[0012] 还提供了包含这种植物的庇护作物。庇护作物可由选自以下的植物构成:玉蜀黍、 大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米和甘鹿。玉蜀黍特别值 得关注。
[0013] 本文提供了使用庇护作物来减少昆虫害虫发展对杀虫剂或者对抗虫转基因植物 所提供的毒素的抗性的方法。
[0014] 附图和序列表的说明
[0015] 由以下的"【具体实施方式】"及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地 理解本公开。
[0016] 图1显示从叶取食选择测定法获得的结果,在该测定法中,将西部玉米根虫(WCR) 甲虫放在具有来自玉蜀黍crwl-Ac突变株的叶子和来自其野生型亲缘株的叶子的盒子中。 结果代表9个生物样品的平均值。
[0017] 图2显示玉蜀黍Crwl基因、crwl-Ac突变株系中的突变的位置以及公共的多样性 株系C0109和NC316中的插入的位置的示意图。
[0018] 图3绘出了Crwl突变植株(MT)和野生型(WT)植株响应机械创伤("机械创伤") 和秋粘虫毛虫(FallArmywormcaterpillar)反合("反合(Regurgitant)")的茉莉酸 (JA)的定量。Crwl突变植株积累较高水平的JA,但仅响应所施加的应激。
[0019] 图4绘出了来自Crwl突变植株(MT)和野生型植株(WT)的幼叶和成叶的对香豆 酸和阿魏酸水平的差异。
[0020] 图5绘出了Crwl突变植株(MT)和野生型植株(WT)的叶木质素含量的差异。
[0021] 图6A-6C显示来自野生型亲缘株的Crwl的cDNA序列与crwl-Ac突变等位基因的 比对,该突变等位基因是切除原始等位基因中存在的自主Ac转座子而得到的。外显子1中 的8bp插入(加框显示)导致预测的肽链在插入位点处过早终止。
[0022] 图7A-7C显示来自野生型亲缘株的Crwl的cDNA序列与crwl-C0109等位基因的 比对。该CrWl-C0109等位基因与其野生型亲缘株相比,在外显子2中添加了Ibp的插入和 两个其他的bp变化(参见图7A中的箭头,其指示插入和bp变化的位置。)在外显子2中 插入Ibp导致CRwl肽的过早终止。
[0023] 图8A-8C显示来自野生型亲缘株的Crwl的cDNA序列与crwl-NC316等位基因的 比对。该crwl-NC316等位基因具有Ibp插入(参见图8A中的箭头)并在第二外显子中具 有45bp插入。该Ibp插入的存在导致在45bp插入的位点处出现过早终止密码子。
[0024] 图 9A-9L显示SEQIDNO:3、10、11、12、13、14、15,16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26和27的多肽的氨基酸序列的多序列比对。当某个位置处的所有残基匹配共有序列的 残基时,则显示该残基;否则显示另外,精确匹配共有序列的残基加框显示。
[0025] 图10显示图9A-9L中所示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分数和趋异 值(divergencevalue)〇
[0026] 图11A-11G显示ZmCrw2与crw2_Mutag突变等位基因之间的比对。
[0027] 图12A-12F显示ZmCrw2与crw2-EMS突变等位基因之间的比对。
[0028] 图13显示玉蜀黍同型半乳糖醛酸聚糖I(Homogalacturonanl,HGAl)基因(也称 糖基转移酶AER61或者Crw2)的结构。显示了两个增变基因(mutator)插入和EMS等位基 因的位置。
[0029] 图 14A-14J显示ZmCrw2 蛋白(SEQIDNO:29)与其同系物(SEQIDNO:34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、49 和 50)的比对。
[0030] 图15显示图14A至14J中所示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分数和 趋异值。
[0031] 图16(A)显示10天龄的籽苗中crw2_Mutag突变等位基因的基因表达。总RNA样 品是从叶子、茎杆和根组织收集,RT-PCR分析是使用基因特异性引物进行。crw2-Mutag突 变株在三个组织中显示出差异表达,并且具有比野生型亲缘株中的转录物长145bp的转录 物。图16 (B)显示crw2-TUSC突变株与其野生型亲缘株比较的RT-PCR分析。
[0032] 图17显示汇编自Lynx数据库的ZmCrw2基因在不同植物组织中的表达。
[0033] 图18显示与crwl-Ac突变株及其野生型亲缘株相比较,来自crw2_EMS突变株 的叶圆片的TBO染色模式。叶子位置数字在每张小图的下方表示,并且每个数字后的 "A"或"B"分别代表叶子的顶端部分或者基部部分。crw2-EMS突变株的叶圆片在整个 发育过程中呈现出均匀的深色染色,相比之下,正常的野生型叶圆片显示深色染色直到过 渡(transition)(叶子数字7),然后是较浅的染色。crw2-EMS突变株TBO染色模式类似 crwl-Ac突变株的TBO染色模式。
[0034] 图19显示在WCR甲虫取食后的不同时间点,与其野生型比较的Crwl突变株的 Crw2转录物水平。在WCR取食45分钟内,野生型植株中Crw2转录物的水平快速上调(A, 上小图)。这种上调在Crwl突变株中在WCR取食时没有观察到(A,下小图)。具有相同的 上样方案的18SrRNA对照在B中表示。
[0035] 图20 (A)显示在成体阶段,Crw2突变株("MT")与野生型("WT")相比,具有较低 水平的细胞壁结合的对香豆酸(PCA)和阿魏酸(FA)以及(B)较低水平的木质素(p< 0. 05 ; 非配对t检验)。
[0036] 本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37C.F.R. § 1. 8211. 825中设 定的关于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的指导规则。
[0037] 该序列表含有遵照NucleicAcidsRes.(《核酸研宄》)13 :3021 3030(1985)和 BiochemicalJ.(《生物化学杂志》)219 (No. 2) :345 373(1984)中描述的IUPACIUBMB标 准进行定义的核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码,所述文献以引用方式 并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R. § 1. 822中设定的规 则。
[0038] SEQIDNO:1是野生型玉米(Zeamays)基因组Crwl的核苷酸序列。
[0039] SEQIDNO:2是野生型玉米Crwl(ZmCrwl)cDNA的编码区的核苷酸序列。
[0040] SEQIDNO:3是野生型玉米CRWl(ZmCRWl)蛋白的氨基酸序列。
[0041] SEQIDNO:4是突变crwl-Ac等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0042] SEQIDNO:5是突变crwl-Ac等位基因编码的多肽的氨基酸序列。
[0043] SEQIDNO:6是来自玉蜀黍近交系C0109的CrwlcDNA的核苷酸序列。
[0044] SEQIDNO:7是SEQIDNO:6编码的多肽的氨基酸序列。
[0045] SEQIDNO:8是来自玉蜀黍近交系NC316的CrwlcDNA的核苷酸序列。
[0046] SEQIDNO:9是SEQIDNO:8编码的多肽的氨基酸序列。
[0047] SEQIDNO: 10是来自水稻(Oryzasativa)的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序 列(UniProt条目G3M8D2)。
[0048] SEQIDNO: 11是来自水稻的推定NAM蛋白(0sNAC7)的氨基酸序列(标识符 0s06g04090.I;UniProt条目Q9SNM6)。
[0049] SEQIDNO:12是来自高粱(Sorghumbicolor)的推定的未表征的蛋白的氨基酸 序列(标识符Sb07g001550.I;UniProt条目C5YM23)。
[0050] SEQIDNO:13是来自高粱的推定NAM蛋白的氨基酸序列(标识符Sbl0g002120. 1 ; UniProt条目Q5NKS7)。
[0051] SEQIDNO:14是来自中国栽培大豆(Glycinemax)的未表征的蛋白的氨基酸序 列(标识符Glymal6g02200.I;UniProt条目I1MKD6)。
[0052] SEQIDN0:15是来自中国栽培大豆的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符 Glyma07g05660.I;UniProt条目I1KHQ4)。
[0053] SEQIDNO:16是来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的含NAC结构域的蛋白43 的氨基酸序列(标识符At2g46770.I;UniProt条目Q84WP6)。
[0054] SEQIDNO:17是来自拟南芥的含NAC结构域的蛋白12的氨基酸序列(Atl g32770.I;UniProt条目Q9LPI7)。
[0055] SEQIDNO: 18是来自拟南芥的含NAC结构域的蛋白66的氨基酸序列(标识符 At3g61910.I;UniProt条目Q9M274)。
[0056] SEQIDNO: 19是来自玉米的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序列(UniProt条目 B4FPS5KSEQIDN0:20是来自玉米的推定NAM蛋白的氨基酸序列(UniProt条目Q5NKQ3)。
[0057] SEQIDNO:21 是来自二糖短柄草(Brachypodiumdistachyon)的含NAC结构域 的蛋白43样的氨基酸序列(NCBIGINo. 357139497,本文中称为BdCRWl)。
[0058] SEQIDNO:22是来自葡萄(Vitisvinifera)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序 列(UniProt条目F6HU82)。
[0059] SEQIDNO:23是来自中国栽培大豆的含NAC结构域的蛋白43样的氨基酸序列 (NCBIGINo.35652248〇,本文中称为GmCRWl)。
[0060] SEQIDNO:24是来自陆地棉(Gossypiumhirsutum)的含NAC结构域的蛋白的氨 基酸序列(UniProt条目G4V2G0)。
[0061] SEQIDNO:25是来自苹果(Pyrusmalus)的NAC结构域类转录因子(NAC12)的 氨基酸序列(UniProt条目D9ZJ90)。
[0062] SEQIDNO:26是来自大麦(Hordeumvulgare)的预测的蛋白的氨基酸序列 (UniProt条目F2DV83)。
[0063] SEQIDNO:27是来自拟南芥的NAM样蛋白的氨基酸序列(NCBIGINo. 3510262 ; UniProt条目Q84WP6)。
[0064] SEQIDNO:28是野生型玉米Crw2 (ZmCrw2)cDNA的编码区的核苷酸序列。
[0065] SEQIDN0:29是野生型玉米CRW2(ZmCRW2)蛋白(也称糖基转移酶)的氨基酸序 列(UniProt条目B6TY42 ;455个氨基酸)。
[0066] SEQIDNO:30是突变的crw2_Mutag等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0067] SEQIDNO:31是突变的crw2_Mutag等位基因编码的多肽的氨基酸序列。
[0068] SEQIDNO:32是突变的crw2-EMS等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0069] SEQIDNO:33是突变的crw2-EMS等位基因编码的多肽的氨基酸序列。
[0070] SEQIDNO:34是玉米推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目C0PDR7 ; 488个氨基酸)。
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