一种防治核桃基腐病的生防菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生防治剂，特别涉及一种以拮抗核桃基腐病病原菌的枯草芽孢杆 菌为主要成分的生防治剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 核桃（Juglans regia L.)属落叶乔木，是我国重要的经济树种，具有丰富的营养 价值和保健功能，可制取食用油和制作各种食品。核桃作为新疆的第二大果树，栽培面积占 全疆林果总面积的四分之一，核桃产业已成为新疆农民致富增收的重要支柱产业之一。核 桃适生范围广，常被栽植于山区和田园，是重要的用材树种和生态树种。近几年，随着新疆 核桃种植面积逐渐扩大，大面积种植单一品种、管理粗放以及栽培模式等原因，病虫害问题 日益增多，核桃基腐病（Pythium oligandrum Drechsler)的大面积严重发生制约了新疆核 桃产业的健康发展，核桃基腐病与腐烂病有本质的区别，核桃腐烂病主要危害支杆的皮层， 皮层上面产生小黑点。
[0003] 目前，防治核桃基腐病的方法主要以化学方法为主，通过大田试验筛选出了咪酰 胺等防效较好的药剂。常规的化学药剂在防治核桃基腐病方面，有经济、高效和方便等优 势，但其易环境污染，不利于打造生态健康果园。最近几年通过生防菌株防治果树病害已成 为一种重要的防治手段，目前应用较多的拮抗细菌主要有芽孢杆菌Bacillus SUbtiliS、假 单胞杆菌Pseudomonas spp·、土壤放射杆菌Agrobacterium radiobacter等。然而通过诘 抗菌株防治核桃基腐病的研宄尚未见报道。因此，筛选出抗菌谱广、生防活性高及对环境安 全的新型拮抗细菌，制备成高效的生防菌剂，对该病害的防治具有重要意义。本申请从分离 核桃基腐病病原菌过程中得到的细菌与病原菌通过平板对峙培养法筛选出抑制效果较好 的生防细菌，并对其进行种类鉴定，将分离得到的生防细菌制备成生防菌株，实现菌株的应 用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种防治核桃基腐病 的菌株。
[0005] 本发明进一步提供利用上述菌株制备的生防菌剂。
[0006] 本发明进一步提供上述生防菌剂的制备方法。
[0007] 本发明进一步提供利用上述生防菌剂的防治方法。
[0008] 本发明人等从新疆和田地区墨玉县采集得的核桃基腐病病害标本中分离出一种 属于枯草芽孢杆的菌株，发现该菌株对植物生长无不良影响，具有抑制核桃基腐病病原菌 的效果，并由此完成了本发明。
[0009] 本发明涉及以下的菌株和核桃基腐病生防菌剂、生防菌剂的制备方法以及利用生 防菌剂防治核桃基腐病的方法。
[0010] (1)枯草芽孢杆菌菌株GY-11。
[0011] (2)含有芽孢杆菌菌株GY-Il作为有效菌的核桃基腐病生防菌剂。
[0012] (3)使用上述（2)中记载的核桃基腐病生防剂进行防治核桃基腐病的防治方法，。
[0013] [枯草芽孢杆菌菌株GY-11的分离与保藏]
[0014] 本发明的枯草芽孢杆菌菌株GY-Il是从新疆和田地区墨玉县采集的核桃基腐病 病害标本中分离出的菌株。
[0015] 具体的，本发明是通过以下步骤得到核桃基腐病拮抗菌菌株GY-Il的：
[0016] (1)拮抗菌株的分离：将核桃基腐病病害标本材料的病健交界部位切成5mm的组 织块，先用75%乙醇消毒该组织块30s，立即取出，再置于1 %次氯酸钠消毒90s，最后用无 菌水冲洗3次后利用灭菌滤纸将组织块表面的水吸干，得到消毒后的组织块。将消毒后的 组织块在PDA培养基上进行培养，培养温度为28°C恒温培养，每24h观察一次，当观察到 组织块周围出现抑菌圈时，使用划线法将抑菌圈的的细菌菌落纯化在NA平板上，得到单菌 落，最后将得到的单菌落于4°C保存。
[0017] (2)拮抗菌株的筛选：将分离得到的单菌落进行活化培养，在距离病原菌2. Ocm 处等距离地将所述单菌落划线至已接种核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌的 PDA平板培养基为对照，每个处理3个重复。28°C恒温培养，待对照的平板培养基的菌丝即 将长满时，测量细菌菌株与病原菌之间的抑菌带宽度，得到对核桃基腐病病菌抑菌带最宽 的拮抗菌株GY-Il。
[0018] 其中，所述PDA培养基的配方是去皮土豆200g，葡萄糖17g，琼脂15g，蒸馏水 lOOOmL，pH 自然。
[0019] 其中，所述NA培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaC15g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL ? pH 7. 2〇
[0020] 该菌株根据其后所述的培养特征和生理生化特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》 和《芽孢杆菌属》的描述，结合分子生物学结果，确定拮抗菌株GY-11为枯草芽孢杆菌的新 菌株，于2015年5月14日作为"枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GY_ll"保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC);保藏地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0021] (a)形态学性质
[0022] 形态：杆状
[0023] 大小：0· 7 ~0· 8X2 ~3 μπι
[0024] 运动性：+
[0025] 鞭毛着生状态：周生
[0026] 芽孢形态：椭圆
[0027] 芽抱大小：0· 6 ~0· 9 X I. 0 ~L 5 μ m
[0028] (b)培养性质
[0029] 菌落形状：圆形
[0030] 菌落颜色：乳白色
[0031] 液体培养基培养：乳白色，白色边缘不圆滑似圆形，表层不规则突起，褶皱明显。
[0032] (c)生理学性质
[0033] 革兰氏染色：+
[0034] 接触酶试验：+
[0035] VP 实验：+
[0036] 甲基红试验：+
[0037] 淀粉水解：+
[0038] 柠檬酸的利用：+
[0039] 卵磷脂试验：_
[0040] 菌膜形成试验：+
[0041] 吲哚物质的生成：_
[0042] 好氧兼性厌氧测定：_
[0043] 硫化氢的产生：_
[0044] 硝酸盐的还原：-
[0045] 2% NaCl ：++
[0046] 5% NaCl ：++++
[0047] 7 % NaCl ：++++
[0048] 10% NaCl ：++
[0049] 需要说明的是，" + "代表阳性，代表阴性，"++"代表生长一般，"++++"代表生 长最适。
[0050] (d)分类学性质
[0051] 菌株GY-11与枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis的16SrDNA序列同源性为99%， 在GenBank注册的序列号为KP876486。从基于邻接法构建的16S rDNA系统发育树（如图 2所不）可以发现；菌株GY-Il与模式菌株枯草芽孢杆菌（KF496886)聚类在同一大分支内 (支持率99% )，并结合菌株的形态学及生理生化特征，最终确定菌株GY-Il为枯草芽孢杆 菌 Bacillus subtilis。
[0052] [GY-11菌株的培养]
[0053] 有关本发明的GY-Il菌株的培养方法可以选择任何适宜的培养基和培养条件。此 外，除液体培养基之外可以使用加入了琼脂的斜面培养基和平板培养基等固体培养基。通 过培养使GY-Il菌株增殖以获得所需的菌体量。
[0054] 培养基中的碳源可以利用所述GY-Il菌株可以同化的所有物质。具体地说，除葡 萄糖、半乳糖、D-土塘、蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物、淀粉水解物等糖之外，还有GY-Il可以利 用的各种合成或天然碳源，但是不包括乙酸。
[0055] 培养基中的氮源，同样的，除含有有机氮的蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、谷氨酸、 酵母膏、磷酸二氢铵、硝酸钾、氯化铵、硝酸钙、天冬氨酸、亚硝酸钠之外，还可以是GY-Il菌 株可以利用的各种合成或天然氮源，但是不包括尿素。
[0056] 根据常规的微生物培养方法，必要时可以相应地添加 NaCl、磷酸盐等无机盐类、 钙、镁、铁等金属盐，维生素、氨基酸等微量营养源。
[0057] 培养可以在摇床培养、震荡培养、通气培养等好氧条件下进行。培养温度为20~ 40°C，优选25~30°C，进一步优选为25°C ;pH5~9,优选6~7,进一步优选为7 ;培养时间 24-48h，优选24h为宜，其中，摇床培养的转速为120-220r/min，优选160-200r/min，进一步 优选为180r/min。
[0058] 为实现本发明的另一目的，本发明提供的一种防治核桃基腐病的生防菌剂是由保 藏号为CGMCC No. 10809的生防菌株GY-Il制备而成，其中，生防菌剂中的活菌总浓度为 1. 6Χ108-3· 8X1010CFU/mL〇
[0059] 为实现本发明再一目的，本发明提供的生防菌剂的制备方法，是将菌种保藏号为 CGMCC No. 10809的生防菌株GY-Il在培养基中震荡培养，经离心处理后，将沉淀用灭菌水 稀释成GY-Il活菌总浓度为I. 6X 108-3. 8X 101(lCFU/mL的菌剂。
[0060] 其中，所述培养基选择NA培养基、NB培养基、PDA培养基、LB培养基中的一种。
[0061] 优选地，所述培养基为NB培养基和LB培养基。
[0062] 其中，所述震荡培养的培养温度为20°C -40°C。
[0063] 优选地，所述震荡培养的培养温度为25°C。
[0064] 其中，所述离心处理的转速为120r/min_220r/min。
[0065] 优选地，所述离心处理的转速为180r/min。
[0066] 其中，所述培养基的起始pH值为5-9。
[0067] 优选地，所述培养基的起始pH值为7。
[0068] 为实现发明的再一目的，本发明提供的利用生防菌剂防治核桃基腐病的方法是： 可以直接施用于核桃基腐病发病部位，也可以用水等稀释后施用于核桃基腐病发病部位。
[0069] 本发明利用新疆和田地区墨玉县采集得的核桃基腐病病害标本中分离出一种枯 草芽孢杆菌株GY-Il对核桃基腐病病原菌具有高效的抑制作用，并且利用该菌株制备的生 防菌剂对核桃基腐病的防治有良好的