组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学领域，特别涉及组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脐带间充质干细胞（MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在 骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前 景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓 MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研宄工作者们的关注。
[0003] 但是，脐带在离体情况下活力会渐渐下降，这直接影响了分离的干细胞数量和质 量。如何维持离体脐带间充质干细胞的活性成为了当务之急。在此之前，人们在RPMI-1640 等基础培养基的基础上添加青霉素、链霉素等物质用于保存离体脐带；或者使用添加了人 血白蛋白、葡萄糖等营养物质用于保存离体脐带。但是由于营养成分单一或没有适宜的缓 冲体系等原因，导致脐带在长期保存或运输中出现活力低下、甚至死亡等现象。为了进一步 的适应临床应用需要，开发一种营养成分多元且体系稳定的脐带保存液成为了当务之急。
[0004]目前的脐带保存液存在如下问题：
[0005] 1.保存液的由基础的培养基构成，营养成分单一，且该成分不一定适合脐带在离 体情况下的所需。
[0006] 2.没有稳定的缓冲溶液体系，保存过程中受外界因素影响较大，脐带保存质量波 动较大。
[0007] 3.配置过程繁琐。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供一种组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法。本发明 提供的脐带保存制剂不仅可为离体脐带提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的 活力及其原有细胞形态及生物特性。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种组合物，包括生理盐水、血浆、双抗和非渗透性冷冻保护剂。
[0010] 非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。非渗透性冷保护 剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、乳糖醛酸或羟乙基淀粉中的 一种或两者以上的混合物。大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自 由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降 低，从而减轻溶质损伤。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，组合物中所述非渗透性冷冻保护剂包括聚乙烯 吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、乳糖醛酸或羟乙基淀粉中的一种或两者以上的 混合物。
[0012] 本发明提供了一种组合物，包括生理盐水、血浆、双抗、乳糖醛酸和羟乙基淀粉。
[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，组合物包括生理盐水、lx~2x青-链霉素、终浓 度为50mg-100mg/mL的乳糖醛酸、终浓度为1% -5% (v/v)羟乙基淀粉、终浓度为5% (v/ v)的脐血浆。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，组合物中所述脐血浆的制备方法为：取脐血，于 2500rpm离心15min，吸取上层淡黄色血浆，4°C保存备用。
[0015] 本发明还提供了所述的组合物在制备脐带保存制剂中的应用。
[0016] 本发明还提供了一种脐带保存制剂，包括所述组合物。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，脐带保存制剂为保存液。
[0018] 本发明还提供了一种所述脐带保存制剂的制备方法，取所述血浆、所述双抗、所述 乳糖醛酸和所述羟乙基淀粉溶于所述生理盐水。
[0019] 本发明还提供了一种脐带的保存方法，采用所述脐带保存制剂保存所述脐带。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，脐带的保存方法具体为取脐带与所述脐带保存 制剂混合，4°C保存。
[0021] 本发明通过研宄发现：该保存液用于维持脐带活力的关键是提供合适的保存环境 及营养供给，保证离体脐带在保存液中避免肿胀死亡。因此保存液中的成分和运输过程中 各条件成为提高脐带活力至关重要的因素。在本发明以前葡萄糖、人血白蛋白常作为维持 脐带养来源。本发明就是在此基础上进一步改进了保存液的缓冲体系和营养体系，同时优 化运输条件，尽可能的维持脐带的活力及其生物特性。
[0022] 本发明以生理盐水作为脐带保存液的基础成分，使用脐血浆作为营养成分来源， 脐血浆是天然的物质，不仅提供多元的营养成分，还为维持与体内相似的微环境，可最大程 度的维持脐带的活力；添加了乳糖醛酸、羟乙基淀粉等大分子物质，避免了脐带在保存过程 中发生肿胀死亡。保存液中各成分组成及其比例。可以在低温下运输和保存制剂。
[0023] 有益效果包括但不限于：
[0024] 1.本发明所制备的保存液能很好的维持脐带活力，不会造成脐带分离提取的间充 质干细胞的数量和质量。
[0025] 2.保存液制备步骤简便，能在短时间内配制大量。
[0026] 3.保存液成本低廉，成分稳定、安全、无任何毒副作用。
[0027] 与现有技术相比，本发明选用了生理盐水作为脐带保存液的基础成分，添加脐血 浆、乳糖醛酸、羟乙基淀粉三种成分，从而形成了成分稳定，营养物质多元、溶液渗透压稳定 的体系。这样不仅可为离体脐带提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的活力及 其原有细胞形态及生物特性。
[0028] 1.保存液中选用生理盐水作为基础成分，其与人体生理渗透压一致，不会对脐带 伤害。另外，保存液中脐血浆为脐带提供多元的、可直接吸收的营养成分，克服了保存液中 营养成分单一的缺点，最大程度的维持了种子细胞活力。
[0029] 2.低温保存制剂，一方面可避免营养成分变性，另一方面则很好的保持了脐带的 生物活性。
[0030] 3.保存液制备需时短，可规模化生产。
[0031] 4.在长途运输保存后，脐带干细胞均未出现生物特性的改变，贴壁率高，增值速度 快。
【附图说明】
[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0033] 图1示脐带干细胞培养结果（4X);其中，图1(A)示脐带干细胞培养3d结果；图 1 (B)示脐带干细胞培养7d结果；
[0034] 图2示脐带干细胞的形态检测结果；
[0035] 图3示脐带干细胞活力检测结果；
[0036] 图4示对照组的保存液脐带保存72h后，分离的脐带干细胞的流式检测结果；
[0037]图5示本发明实施例1提供的保存液样品组脐带保存72h后，分离的间充质干细 胞的流式检测结果；
[0038] 图6示空白对照组（不加抗体）的保存液脐带保存后，分离的间充质干细胞的流 式检测结果；
[0039] 图7示对照组A提供的保存液（样品组）胎盘保存后，分离的间充质干细胞的流 式检测结果；
[0040] 图8示空白对照组（不加抗体）的保存液胎盘保存后，分离的间充质干细胞的流 式检测结果；
[0041] 图9示对照组B提供的保存液（样品组）胎盘保存24h后，分离的间充质干细胞 的流式检测结果。
【具体实施方式】
[0042] 本发明公开了一种组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法，本领域技术人 员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0043] 本发明提供的组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法中所用原料及试剂均 可由市场购得。其中，lx青-链霉素（双抗）购自Gibco公司，每毫升包含10000单位青霉 素（碱）和10000 y g链霉素（碱），利用〇? 85%盐液形式的青霉素G (钠盐）和硫酸链霉 素。
[0044] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0045] 实施例1保存液的制备：
[0046] 在生理盐水中，添加双抗、乳糖醛酸、羟乙基淀粉、脐血浆，使得生理盐水中含有lx 青-链霉素（双抗）、终浓度为l〇〇mg/mL乳糖醛酸、终浓度为1 % (v/v)的羟乙基淀粉、终 浓度为5% (v/v)的脐血浆混匀后置4°C保存备用。
[0047] 实施例2保存液的制备：
[0048] 在生理盐水中，添加双抗、乳糖醛酸、羟乙基淀粉、脐血浆，使得生理盐水中含有2x 青-链霉素（双抗）、终浓度为50mg/mL乳糖醛酸、终浓度为5% (v/v)的羟乙基淀粉、终浓 度为5% (v/v)的脐血浆混匀后置4°C保存备用。
[0049] 实施例3保存液的制备：
[0050] 在生理盐水中，添加双抗、乳糖醛酸、羟乙基淀粉、脐血浆，使得生理盐水中含有lx 青-链霉素（双抗）、终浓度为80mg/mL乳糖醛酸、终浓度为3% (v/v)的羟乙基淀粉、终浓 度为5% (v/v)的脐血浆混匀后置4°C保存备用。
[0051] 实施例4脐带保存运输：
[0052] 在医院产房把刚分娩的脐带放入装有本发明实施例1制备的4°C保存液的瓶子 中，保存液浸没脐带，置于4°C保存，脐带采集后12小时内进入实验程序。
[0053] 实施例5脐带间充质干细胞分离培养
[0054] A、在超净台内用镊子取出实施例4保存后的脐带，置于15cm的玻璃平皿中，用 4°C PBS对脐带进行初步清洗，转移至新的15cm培养皿中，将其剪成数段，并剔除中间三根 血管；
[0055] B、位于羊膜