一种植物杀菌剂的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于防治农作物真菌病害的植物提取物的制备方法和作为杀菌 剂的应用，属于农药技术领域。
【背景技术】
[0002] 农药是防治农作物病虫草害，有效地保障农业增产，增收的重要生产资料之一，化 学农药的广泛使用对农业发展起了巨大的作用，但由于许多化学杀菌剂作用位点单一，且 在单一生长季需多次使用，易使病原菌产生严重抗药性，其残留严重破坏生态环境安全，威 胁食品安全。
[0003]植物源农药是利用植物根、茎、叶、花、果实和种子等部分浸提或分离到的活性成 分加工成的制剂。植物源农药的利用可分为两方面，一是直接利用，即对植物中的活性物 质进行粗提取后，直接加工成可利用的制剂。这种利用方式的主要优点是能够发挥粗提物 中各种成分的协同作用，而且投资少，开发周期短。目前，我国在这方面研宄较多，已开发 出楝素乳油、苦皮藤乳油、鱼藤酮乳油、双素碱水剂、油酸烟等多种商品化制剂；二是间接利 用，即研宄活性物质的结构、作用机制、结构与活性间的关系，进而人工模拟合成筛选，从而 开发出新型的农药制剂。植物源农药具有以下特点：（1)具有多种生物活性，不仅有杀虫 活性，还兼有杀菌和刺激植物生长的活性；（2)对人畜及非靶标生物毒性低，在环境中降解 快，低残留，不污染环境；（3)害虫不易产生抗性；(4)原料较易得到，可就地取材，就地加 工，使用成本较低。目前，植物源农药越来越受到人们的青睐，是今后生态农药发展的重点 方向。
[0004] 臭蒿（Artemisia hedinii Ostenf. et Pauls.)，为一年生草本，植株有浓烈臭味。 具有有清热、解毒、凉血、消炎、除湿之效，是中国传统的中药，药用价值高，但是其作为植物 杀菌剂在植物真菌病害防治方面的功效尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种以臭蒿叶提取物为活性物质的杀菌剂，作为杀菌剂的应 用可以有效防治烟草黑胫病及赤星病。
[0006] 本发明提供了一种制备该植物杀菌剂的制备方法，包括由臭蒿（Artemisia hedinii Ostenf. et Pauls.)叶提取物和助剂加工而组成，该杀菌剂中各组分所占质量百 分比是：臭蒿叶叶提取物：20 %，乳化剂：80 %。
[0007]该方法包括如下步骤：
[0008] (1)将臭蒿叶于50°C烘干至恒重，然后机械粉碎至40目；
[0009] (2)将上述粉碎的臭蒿叶与无水乙醇等比例混合，质量体积比1/1，于60°C水浴锅 震荡恒温水浴提取3天，滤出提取液；在滤渣中重新加入等比例无水乙醇相同条件提取2 天，滤出提取液，在滤渣中再次加入等比例的无水乙醇相同条件提取1天。将三次所得提取 液合并，即获得臭蒿叶粗提物；
[0010] (3)将臭蒿叶粗提物用旋转蒸发仪40°C旋蒸48小时，蒸去乙醇、获得浓缩后的臭 高叶提取物；
[0011] (4)将浓缩后的臭蒿叶提取物用等相当于其体积4倍的吐温80溶剂混合制成乳液 即可。
[0012] 该杀菌剂可应用于抑制烟草黑胫病病原菌和烟草赤星病病原菌的菌丝生长和病 原孢子的萌发。
[0013] 在团棵期灌根施用该杀菌剂（按上述方法所制备杀菌剂用蒸馏水稀释10倍灌根 施用，每株烟施用稀释后的杀菌剂lOOmL)可以防治烟草黑胫病。
[0014] 在叶面喷施该杀菌剂可以防治烟草赤星病。
[0015]图1为臭蒿叶杀菌剂对烟草黑胫病病原菌丝生长的抑制作用。
[0016]图2为臭蒿叶杀菌剂对烟草赤星病病原菌丝生长的抑制作用。
[0017]图3为臭蒿叶杀菌剂对烟草黑胫病病原孢子萌发的抑制作用。
[0018]图4为臭蒿叶杀菌剂对烟草赤星病病原孢子萌发的抑制作用。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 :臭高叶杀菌剂的制备
[0020] (1)将臭蒿叶于50°C烘干至恒重，然后机械粉碎至40目；
[0021] (2)将上述粉碎的臭蒿叶与无水乙醇等比例混合，质量体积比1/1，于60°C水浴锅 震荡恒温水浴提取3天，滤出提取液；在滤渣中重新加入等比例无水乙醇相同条件提取2 天，滤出提取液，在滤渣中再次加入等比例的无水乙醇相同条件提取1天。将三次所得提取 液合并，即获得臭蒿叶粗提物；
[0022] (3)将臭蒿叶粗提物用旋转蒸发仪40°C旋蒸48小时，蒸去乙醇、获得浓缩后的臭 高叶提取物；
[0023] (4)将浓缩后的臭蒿叶提取物用等相当于其体积4倍的吐温80溶剂混合制成臭蒿 叶杀菌剂乳液。
[0024] 实施例2:臭蒿叶杀菌剂对烟草黑胫病和烟草赤星病病原菌丝生长的抑制
[0025] 按照本发明所获得的杀菌剂，按照植物病害研宄法推荐的生长速率测定法，对烟 草黑胫病和烟草赤星病病原菌进行了生物活性测定：用打孔器取6_菌落边缘生长旺盛的 病原菌菌种，放在加药的PDA平板上面，以培养基内加等量的无菌水作为对照，每次重复3 次，置于28°C恒温培养，用十字交叉法测定每个菌落的直径，以其平均值为代表菌落的直 径，以下列公式求出抑制菌丝生长率：
[0026] 抑制菌丝生长率=(对照菌落直径一处理菌落直径V(对照菌落直径一 0. 6) X100%
[0027] 表1、臭蒿叶杀菌剂对烟草黑胫病病原菌丝生长的抑制作用
[0028]
[0029] 表2、臭蒿叶杀菌剂对烟草赤星病病原菌丝生长的抑制作用
[0031] 实施结果表明（表1、表2)，臭蒿叶杀菌剂对烟草黑胫病病原菌和烟草赤星病病原 菌菌丝生长具有较好的抑制作用（图1、图2 :A)，抑制率均在80%以上。
[0032]实施例3 :臭蒿叶杀菌剂对烟草黑胫病和烟草赤星病病原孢子萌发的抑制作用
[0033] 按照本发明所获得的杀菌剂，按照植物病害研宄法推荐的对烟草黑胫病和赤星病 病原孢子。
[0034]用无菌水将在马铃薯蔗糖琼脂培养基上培养7天后赤星病病原菌的孢子洗脱下 来并振荡摇匀，通过二倍稀释法使其在显微镜低倍镜（X40)视野中保持个数为100左右。 所需浓度的臭蒿叶杀菌剂用上述方法所提的原液稀释10。采用载玻片悬滴法，将孢子悬浮 液10 y L滴在凹玻片上，将臭蒿叶杀菌剂稀释液取10 y L滴加在孢子悬浮液中，对照组取等 量的蒸馏水作同样处理。28°C培养5h后观察孢子萌发情况，每组包含三个重复，并计算孢 子萌发抑制率。
[0036] 表3、臭蒿叶杀菌剂对烟草赤星病病原和黒胫病病原孢子萌发的影响
[0038] 实施结果（表3)表明，臭蒿叶杀菌剂对烟草赤星病和黑胫病病原孢子萌发具有较 好的抑制作用，抑制率在90%以上。由图3、图4可以看出，经本杀菌剂处理（A)的烟草黑 胫病和赤星病病原孢子萌发受到抑制不能长出菌丝，而对照（B)中病原孢子大量萌发产生 菌丝（1)。
[0039] 实施例4:臭蒿叶杀菌剂防治烟草黒胫病的应用
[0040] 烟草黑胫病防治试验：
[0041] 按照本发明所获得的杀菌剂，按照植物病害研宄法推荐的方法进行烟草黑胫病以 及烟草赤星病防治试验。采用灌根接种法，选择生长势大小相同的团棵期的烟株（品种：白 肋烟鄂烟1号）进行试验，先用臭蒿叶杀菌剂进行灌根处理（按上述方法所制备杀菌剂用 蒸馏水稀释10倍灌根施用，每株烟施用稀释后的杀菌剂lOOmL)，以等量的清水灌根作为对 照，24小时后用黑胫病病原菌孢子悬液（浓度为10 5个/mL)灌根接种，采用俞大绂对烟草 黑胫病的分级标准，计算病情指数及相对防效。
[0042] 表4、臭蒿叶提取物对烟草黑胫病防治效果
[0044] 实施结果（表4)表明、臭蒿叶杀菌剂能有效防治烟草黑胫病，相对防效为71%，略 低于化学农药甲霜灵的防治效果。
[0045] 实施例5:臭蒿叶杀菌剂防治烟草赤星病的应用
[0046]烟草赤星病防治试验：
[0047] 赤星病病原菌孢子悬液（浓度1X106个/ml);
[0048] 选取烤烟K326烟苗9-10叶期的第4、5片叶；
[0049]臭蒿叶杀菌剂200mg/mL(由lg/mL母液稀释而成）、菌核净500倍稀释、吐温-80、 饱和漂白溶液（次氯酸钠溶液）、蒸馏水；
[0050] Hoagland完全培养液（100倍备用）：硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸铵 115mg/L、硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5ml/L、微量元素（自来水）5ml/L。
[0051] 1、将叶片浸入饱和漂白溶液15min，再用无菌水冲洗3次，再用臭蒿叶杀菌剂（按 上述方法制备）喷施于叶面（对照分别为吐温-80、化学农药菌核净、蒸馏水）取出叶片放 入培养皿中；
[0052] 2、添加适量Hoagland完全培养液于培养皿中，用悬滴法[11]滴7-10滴病原孢子 悬液至叶片上，28°C培养6天。每天补充营养液（10mL)，稍没过皿底部（25mL)即可；培养 皿数的确定根据可采叶片数和已有的培养皿数适当调整，叶片尽量保持完整）。
[0053] 3、计算发病率，并记录病级。
[0054] 发病率=接种后发病点数/总接种点数
[0055] 病级：1级--发病率为CK25% ;2级--发病率为25-75 % ;3级--发病率为 75--100%，病斑不扩展；4级--发病率为100%，50%叶片面积枯死；5级--发病率为 100%，100 %叶片面积枯死。
[0056] 表5、臭蒿叶提取物对烟草赤星病防效
[0058] 实施结果（表5)表明，臭蒿叶杀菌剂能有效防治烟草赤星病，相对防效可达 60. 9%，与化学农药菌核净的防效相当。
【主权项】
1. 一种植物杀菌剂的制备方法，其特征在于，包括由臭蒿叶提取物和助剂加工而组成， 该杀菌剂中各组分所占质量百分比是：臭蒿叶叶提取物：20%，乳化剂：80%，制备包括如下 步骤： (1) 将臭蒿叶于50°C烘干至恒重，然后机械粉碎至40目； (2) 将上述粉碎的臭蒿叶与无水乙醇等比例混合，质量体积比1 / 1，于60°C水浴锅震 荡恒温水浴提取3天，滤出提取液；在滤渣中重新加入等比例无水乙醇相同条件提取2天， 滤出提取液，在滤渣中再次加入等比例的无水乙醇相同条件提取1天，将三次所得提取液 合并，即获得臭高叶粗提物； (3) 将臭蒿叶粗提物用旋转蒸发仪40°C旋蒸48小时，蒸去乙醇、获得浓缩后的臭蒿叶 提取物； (4) 将浓缩后的臭蒿叶提取物用等相当于其体积4倍的吐温80溶剂混合制成乳液即 可。2. 根据权利要求1所述的植物杀菌剂的应用，其特征在于，用于防治烟草黑胫病，方法 为将杀菌剂用蒸馏水稀释10倍，在烟草团棵期每株灌根施用稀释后的杀菌剂100 mL。3. 根据权利要求1所述的植物杀菌剂的应用，其特征在于，用于防治烟草赤星病，方法 为将杀菌剂喷施与烟叶表面。
【专利摘要】本发明涉及一种植物杀菌剂及其制备方法和作为杀菌剂的应用，特别是涉及一种防治烟草黑胫病和赤星病的植物提取物及其制备方法。该杀菌剂是由臭蒿叶（Artemisia hedinii Ostenf. et Pauls.）经过烘干，浸提、浓缩以后，通过与乳化剂吐温-80按一定比例配制加工而成。使用本发明能有效抑制烟草黑胫病和赤星病病原菌丝生长和病原孢子萌发，进而有效防治烟草黑胫病和赤星病，为有效防治烟草黑胫病和赤星病提供了一种高效、低毒、低残留的植物源农药。
【IPC分类】A01N65/12, A01P3/00
【公开号】CN104938525
【申请号】CN201510273945
【发明人】杨春雷, 余君, 胡国元, 杨锦鹏, 李俊超
【申请人】湖北省烟草科学研究院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月26日