一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转基因作物生态风险评价技术领域，具体涉及一种评价转基因抗虫水 稻水生环境安全性的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国的主要农作物之一，通过转基因育种方法增强水稻自身的抗性为病虫 害防治提供了高效的解决途径。目前已经成功地培育出了一批具有高产、抗病虫以及抗除 草剂等性状的转基因水稻品种，其中一些转基因水稻品系已经进入了环境释放试验等国家 生物安全评价阶段，为我国的粮食安全保障提供了技术储备。然而，转基因作物的种植可能 会带来一系列的安全问题，因而引起了全球的广泛关注和争论。由于水稻在我国的重要性， 环保和农业等部门对转基因水稻安全性的关注似乎超出任何一个其它转基因作物，有关转 基因水稻生态风险评价的研宄受到了高度重视。
[0003] 近年来，就一些转基因抗虫水稻品系的基因漂流、靶标害虫的抗性风险、对非靶标 生物和稻田节肢动物群落的影响以及毒蛋白在土壤中的残留等方面已经取得了一些进展， 为转基因水稻的安全性评价积累了一定的经验和技术。以往的研宄多数只限于考查转基因 抗虫水稻对稻田节肢动物的影响，而很少对稻田淡水生态系统中其它重要的类群一一水生 原生动物（鱼类的重要饵料）加以关注。对于转基因水稻的大规模种植是否会对水体原生 动物群落带来不利影响，有多大的影响，目前这方面的研宄报道和结果积累甚少。因此，在 评价转基因水稻环境安全的过程中，有必要补充和加强对水生环境安全影响的部分。
[0004] 转基因作物对土壤生态系统的影响是近年来关注的一个焦点，因为土壤是物质和 能量循环的重要场所，外源蛋白最先进入土壤，理论上土壤生态系统最可能受到潜在的负 面影响。2000 年，美国 EPA(US Environmental Protection Agency)将转基因作物对土壤 生态系统的影响列为风险评价的重要组成部分，转基因作物对土壤生态系统的影响是继转 基因作物与近缘物种基因流、目标害虫抗性问题和对非目标生物影响之后的又一个热点问 题。一项新研宄表明大面积种植转基因玉米可能会对附近水生生态系统造成影响。该研宄 证明转基因玉米的花粉及其他部分可以流入玉米地周围的沟渠中，并用试验揭示转基因玉 米的附产物可增加一种被称作石蛾的水生昆虫的死亡率，降低其增长率。
[0005] 在我国的许多地方，稻田和鱼塘往往交织在一起，而且素有稻田养鱼、稻鸭共生等 传统生态种植模式，再加上水稻田的特殊灌溉方式，即从上游田到下游田的串联灌溉。如果 转基因水稻存在对水体生态系统存在类似转基因玉米的安全性问题，则极易波及到下流的 水田和鱼塘生态系统。因此，转基因水稻对水田及下游水生生态系统是否有安全性问题更 加值得注意。
[0006] 中国专利CN104361251A中涉及转基因棉花对生物安全性评价的方法，通过架设 频振式杀虫灯诱集棉田昆虫的成虫；通过肉眼调查整株棉花上的体形较大的节肢动物；采 用吸虫器吸取棉花全株以及地面范围内的所有体形较小的节肢动物；利用体式显微镜检验 吸虫器收集回的节肢动物进行分类。没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。
[0007] 中国专利CN104133054A提供了一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方 法，用取食转基因棉花叶片1-3天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫；观察大草蛉幼虫生长发 育情况，从而评价转基因棉花对大草蛉的影响，该生物测定方法适用广泛，对利用"转基因 植物-害虫-捕食性天敌"营养关系评价转基因植物中高剂量蛋白对捕食性天敌的影响都 能够进行有效测定。
[0008] 中国专利CN102986462A涉及一种利用双斑青步甲评价转Bt基因棉花抗虫性的检 测方法。该方法利用棉田生态系统中的食物链关系、即双斑青步甲-棉铃虫-棉花，以捕食 者种群的数量反映转Bt基因棉花对靶标生物-鳞翅目昆虫（棉铃虫）的致死程度。在多 年种植转Bt棉花棉田和对照棉花棉田内，利用陷阱法和引诱剂法相结合诱捕双斑青步甲， 比较两种棉花棉田内的双斑青步甲数量。没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。
[0009] 中国专利CN102948399A涉及一种水生生物大型蚤的饲养方法。克服了传统大型 蚤毒理实验技术的缺陷，建立了一套纯稻米饲养大型蚤的方法，包括：营养液配置，米粉溶 液配置，幼蚤的饲养和收集。本发明使用纯稻米饲养大型蚤，克服了常规方法中大型蚤选择 性摄取绿藻等天然食物而不取食或很少取食稻米的缺陷；且消除了因绿藻营养成分不确定 而易影响实验结果的不利因素，为评价转基因水稻安全性提供了可靠的实验保障。此方法 只适用于转基因植物环境安全室内评价。
[0010] 中国专利CN102169117A涉及一种基于模糊数学和典范对应分析方法来评价转基 因植物种植对土壤微生态影响的技术体系及其应用。提供了一种综合考虑土壤微生物与物 理化学指标的评价方法，应用该方法可有效评价转基因作物种植对土壤微生态系统带来的 影响。没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。
[0011] 从以上分析可以看出，对转基因抗虫水稻环境安全评价仅强调了对地上生态系统 的影响，对土壤生物以及水生生物的影响研宄较少。理论上，转基因抗虫水稻的毒蛋白可 以通过根系的分泌进入土壤和水体，也可以通过水稻的碎肩甚至是地上部分的残体进入土 壤，从而对地下或水生微小生物和小型动物产生影响。因此，亟需发明一种适用于对水生生 物安全评价的方法。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，通过设计 稻田布置、水层和淤泥中外源蛋白的测定、浮游生物的分离与测定等步骤，可以系统地评估 转基因抗虫水稻的水生环境安全性。
[0013] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0014] 一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法，包括如下过程：
[0015] (1)转基因稻田和非转基因稻田布置和管理；
[0016] (2)稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定；
[0017] (3)稻田水层中浮游生物的分离；
[0018] (4)稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定；
[0019] (5)转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价。
[0020] 根据以上方案，所述转基因稻田和非转基因稻田布置和管理包括如下步骤：
[0021] 1)选择地势平整、水源方便的田块3至5块（即用于环境安全评价的3至5次重 复），田块面积400-600m2,长宽比范围2 : 1至I : 1，田周边及水源无生活污水污染；
[0022] 2)将步骤1)中的田块划分成小区，田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠；为防止暴 雨漫灌，田块周边建立良好排水沟；
[0023] 3)在步骤2)中的上游小区种植转基因抗虫水稻，下游小区种植非转基因水稻，中 间两块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉，两侧的两块小区直接用水源中的水灌 溉；
[0024] 4)从移栽至成熟期，不施用化学农药，人工除草，中期不晒田。
[0025] 根据以上方案，所述田块划分成小区的具体方案为：靠近水源的上游小区并列设 置两块转基因小区，位于转基因小区下游的下游小区并列设置4块非轩基因小区；所述两 块转基因小区的上游与水源之间分别设立连通沟渠、下游分别与中间的两块非转基因小区 通过沟渠连通；所述非转基因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通；所述4块非 轩基因小区分别设置排水沟渠。
[0026] 根据以上方案，所述稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定，包括样本的预处理和外 源蛋白的抽提与通过酶联免疫吸附法（ELISA法）测定，具体包括如下步骤：
[0027] 1)水样采集及预处理：水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区，用 IOml离心管进行田间水样采集，各小区分别取5管，取上层清水，拿回室内，将每份样品转 到新的IOml离心管中，然后进行冷冻，冷冻后封上封口膜，用针头在膜上扎空，然后放入冷 冻干燥机进行浓缩至干；将干燥后的样品放入4°C低温保存，24小时内待测；
[0028] 2)淤泥样品采集及预处理：土样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 各拔5蔸水稻取根围淤泥，装入50ml离心管，带回室内放入-20°C冰箱冷冻，然后放入冷冻 干燥机进行浓缩至干，将干燥后的淤泥碾碎，过80目筛除去根毛，准确称取每份样品0. 5g， 转入到I. 5ml离心管中，放入4°C低温保存，24小时内待测；
[0029] 3)外源蛋白抽提缓冲液配制：100mM Na2CO3, IOOmM NaCl，5mM乙二胺四乙酸，IOmM 二硫苏糖醇，50mM Na4P2O7* IOH20,1% (v/v)聚乙二醇辛基苯基醚，pH值为1