基因沉默的制作方法
【专利说明】基因沉默
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请主张2012年12月18日提交的美国临时专利申请61/738, 651的优先权。 这个申请在此并入作参考。
[0003] 序列提交
[0004] 电子形式序列表与本申请一起提交。序列表的题目为 2312128PCTSequenceListing. txt，在2013年12月5日建立，大小为27kb。电子形式序列 表中的信息以其全部内容并入作参考。
[0005] 发明背景
[0006] 本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因（endogene)的转录基因沉默 (TGS)。更特别地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效地沉默感 兴趣基因如内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS 在植物、植物组织或植物细胞中更有效地降低内源基因表达的方法。
[0007] 本文中用于阐明本发明的背景或者提供关于实施的其它详细描述的出版物或其 它材料均并入做参考，方便起见在参考文献中分别归类。
[0008] 在十多年之前，Matzke及其同事报道了植物中转基因启动子（NOS)的转录基因沉 默（TGS)与启动子DNA的甲基化之间的关系（Matzke et al.，1989)。自此，对植物中潜在 的TGS机制在单子叶植物和双子叶植物中针对转基因和内源基因进行了广泛研宄（参见 (Matzke and Matzke, 2004 ;Eamens et al.，2008 ;Matzke et al.，2009))。目前对 TGS 的 研宄提示通过双链RNA加工机制（AG04，DCL3)产生的21-24nt小RNAs (sRNAs)靶向具有序 列同源性的基因组区域。这些sRNA通过DNA甲基转移酶（DRM1/2，MET1，CMT3)的作用指导 DNA甲基化，并推测这随后是涉及组蛋白甲基转移酶和去乙酰酶的组蛋白修饰，以建立在甲 基化基因座的抑制性染色质状态。
[0009] 使用转基因作为模型系统的早期研宄揭示了植物中TGS相关的一些基本特征 (Mette et al.，2000 ;Jones et al.，2001 ;Sijen et al.，2001)。这些研宄表明长发夹结 构为产生靶向转基因启动子的sRNA所需。对沉默的转基因的DNA分析证实对称和不对称的 胞嘧啶甲基化均增加，并且METl参与沉默基因座的维持。相似地，长反向重复（IR)也已经 证实介导水稻中35S启动子的有效TGS (Okano et al.，2008)。显然，有义（S)或反义（AS) 方向的单链沉默子不能在烟草和拟南芥中有效产生sRNA及产生TGS(Mette et al. ,2000)。
[0010] 尽管关于转基因的TGS的事件顺序相对充分明确，但是还未知相似的步骤是否也 用于内源基因座（后文称作内源基因）的TGS。令人惊奇地，迄今为止仅报道了少数内源基 因座的TGS，均是使用IR RNA。Cigan et al. (2005)报道成功和强力地沉默两个玉米内源 基因 （Cigan et al.，2005)。在矮牵牛花、马铃薯和水稻中针对一些内源基因观测到中等 沉默（Sijen et al·，2001 ;Heilersig et al·，2006 ;0kano et al·，2008)。IR RNA 触发 内源基因 TGS的无效性在使用单子叶水稻模型的综合研宄中得到充分例证。感兴趣地，在 水稻中检验的7个内源基因中有6个示出对通过从IR RNA结构中产生的sRNA所致沉默是 抗拒的（Okano et al.，2008)。相反，在相同的实验中，示出35S启动子可以被祀向这个启 动子的IR RNA有效沉默。其它不成功的试验（八氢番茄红素脱氢酶（H)S)和查耳酮合成 酶（CHS))也已经在拟南芥中报道（Eamens et al.，2008)。总之，这些结果提示内源性基因 座也许具有可阻止意外的TGS的一些固有性质；或者，需要探宄针对内源性基因座的更有 效的沉默策略。除了观测到的在内源基因座的基因沉默的低成功率，也存在针对内源基因 的TGS与DNA甲基化之间以及DNA甲基化与组蛋白修饰之间的差异（Okano et al.，2008)。 在水稻中大多数情况，靶向启动子区域的IRRNA可以触发同源序列的DNA甲基化，但是其不 能诱导染色质修饰和TGS (Okano et al.，2008)。
[0011] 希望开发增强植物中转录基因沉默的核酸构建体和方法。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默（TGS)。更特别 地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效沉默感兴趣的基因如内 源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS更有效地降 低植物、植物组织或植物细胞中内源基因表达的方法。
[0014] 第一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如本文所述的植物可操作启动子，所 述植物可操作启动子与包含如本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接，所述沉默 增强子与如本文所述的核酸沉默子分子可操作地连接。所述核酸构建体可任选包含其它调 节序列，如3'调节序列，或者如本文所述的其它序列。根据这个方面，本发明还提供了如 本文所述的分离的沉默增强子及核酸构建体，所述核酸构建体包含如本文所述的植物可操 作启动子，所述植物可操作启动子与包含如本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连 接。在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOR OF ddc (SDC)的启动子区域。在一个 实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID N0:6所示序列。在另一实施方案中，沉默增强子包含 SEQ ID NO: 3所示序列。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的 1-389位核苷酸，及连续的并且与第389位核苷酸在3'连续的任何数目的核苷酸。在一些 实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18所 示序列。在其它实施方案中，沉默增强子由SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO: 18.所示序列组成。
[0015] 在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOR OF ddc (SDC)的启动子区域。在 另一实施方案中，沉默增强子可包含与SEQ ID N0:l、3、4、5、6或18具有至少80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97 %、98%、99 %、或100 %序列相同性的核酸序列。沉默增强子可包含在严格条件下与包 含SEQ ID NO: 1、3、4、5、6或18的完全互补序列的DNA分子杂交的核苷酸序列。沉默增强 子可包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列来自SEQ ID NO: 1、3、4、5、6或18,通过选自如下 至少一种方法改变一或多个核苷酸：缺失、取代、添加和插入。沉默增强子可包含核苷酸序 列，其中所述核苷酸序列相应于SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子的等位基因。
[0016] 在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS 负调节的植物内源基因的启动子区域。该第一个实施方案的核酸沉默子分子编码单链沉默 子，其为从核酸构建体转录的RNA分子，或者编码从核酸构建体转录的反向重复沉默子。单 链沉默子或反向重复沉默子在植物、植物组织和植物细胞中提供内源基因的TGS。在一个实 施方案中，单链沉默子是从植物内源基因靶（即核酸沉默子分子）的启动子区域产生的RNA 分子，其相对于核酸构建体中的植物可操作启动子处于反义方向。在另一实施方案中，单链 沉默子是从植物内源基因靶（即核酸沉默子分子）的启动子区域产生的RNA分子，其相对 于核酸构建体中的植物可操作启动子处于有义方向。在每个这些实施方案中，所述构建体、 核酸沉默子分子和单链沉默子均不存在反向重复结构，即核酸构建体及由其产生的产物中 不存在反向重复结构或者反向重复。在再一个实施方案中，核酸沉默子是从植物内源基因 靶的启动子区域产生的RNA分子，其以一式两份提供并排列成相对于核酸构建体中的植物 可操作启动子的反向重复构型。核酸沉默子分子的表达产生初始的单链RNA。这个单链的 RNA可以通过细胞机制或者由于反向重复结构而转变为双链RNA。
[0017] 在一个实施方案中，sRNA在含有核酸沉默子分子的细胞中从表达的核酸沉默子分 子产生。在另一实施方案中，沉默增强子在含有与所述核酸沉默子分子可操作地连接的沉 默增强子的细胞中增强sRNA从表达的核酸沉默子分子的产生。
[0018] 在一个实施方案中，核酸沉默子分子包含位于靶内源基因的转录起始位点上游的 核苷酸。在另一实施方案中，核酸沉默子分子包含位于靶内源基因的转录起始位点上游的 核苷酸及位于其转录起始位点下游的核苷酸。在一些实施方案中，核酸沉默子分子包含内 源基因的大约300个连续核苷酸至大约1500个连续核苷酸的启动子区域。在其它实施方 案中，核酸沉默子分子包含内源基因的大约400个连续核苷酸至大约1200个连续核苷酸的 启动子区域。在另外的实施方案中，核酸沉默子分子包含内源基因的大约425个连续核苷 酸至大约1100个连续核苷酸的启动子区域。在进一步的实施方案中，核酸沉默子分子包含 内源基因的大约425个连续核苷酸至大约1075个连续核苷酸的启动子区域。
[0019] 在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS 负调节的植物内源基因的启动子区域。在另一实施方案中，核酸沉默子分子包含被负调节 的内源基因转录起始位点5'紧邻的2000个核苷酸，或者该2000个核苷酸的区域的片段。 所述片段可包含该区域的至少 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个连续核苷酸，所述区域是被负调节的内 源基因的转录起始位点5'紧邻的2000个核苷酸。
[0020] 在植物中可操作的任何启动子均可用于所述核酸构建体中，以驱动核酸分子的表 达。在一些实施方案中，启动子是植物可操作启动子，包括如本文所述那些的单一拷贝。在 其它实施方案中，启动子是植物可操作启动子的双拷贝，以产生同源双启动子。在进一步的 实施方案中，启动子是两个不同启动子的组合，以产生异源双启动子。
[0021] 第二方面，本发明提供了包含所述核酸构建体的转基因植物细胞。在一个实施方 案中，所述核酸构建体稳定整合在转基因植物细胞的基因组中。在另一实施方案中，核酸在 转基因植物细胞中表达。
[0022] 第三方面，本发明提供了包含核酸构建体的转基因植物。在一个实施方案中，核酸 构建体稳定整合在转基因植物的基因组中。在另一实施方案中，核酸在转基因植物中表达。
[0023] 第四方面，本发明提供了一种在植物、植物组织或植物细胞中通过转录基因沉默 更有效地沉默感兴趣的基因，如更有效地沉默内源基因表达的方法。在一个实施方案中，所 述方法包括用核酸构建体转染植物细胞以产生如本文所述的转基因植物细胞。所述方法进 一步包括在如本文所述的转基因植物细胞中表达如本文所述非核酸沉默子分子分子。本文 所述的表达的核酸沉默子分子在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个小RNA(sRNAs)， 其诱导转录基因沉默以降低感兴趣的靶基因的表达。在一些实施方案中，核酸沉默子分子 的表达产生初始的单链RNA。这个单链的RNA可以通过细胞机制或者由于反向重复结构而 被转变为双链RNA，之后加工产生sRNA。所述方法可任选包括制备编码如本文所述的核酸 的核酸构建体。在另一实施方案中，所述方法包括从转基因植物细胞再生转基因植物。在 这个实施方案中，核酸沉默子分子在转基因植物中表达。表达的核酸沉默子分子在转基因 植物细胞中被切割，产生一或多个sRNA，其诱导转录基因沉默，以降低感兴趣的靶基因的表 达。
[0024] 第五方面，本发明提供了鉴别和获得用于植物TGS中的其它沉默增强子的核酸构 建体和方法。根据这个方面，核酸构建体是适于转化希望鉴别沉默增强子的植物物种的核 酸构建体。在一个实施方案中，核酸构建体可以包含在载体中。在一些实施方案中，载体适 于农杆菌介导的转化。在其它实施方案中，载体可以适于生物射弹（biolistic)介导的转 化。适于植物转化的其它合适的载体为本领域技术人员熟知。在另一实施方案中，核酸构 建体可以根据本领域技术人员熟知的技术直接用于转化植物。核酸构建体包含与推定的沉 默增强子可操作地连接的植物可操作启动子，所述推定的沉默增强子与如本文所述的核酸 沉默子分子可操作地连接，所述核酸沉默子分子与植物可操作的3'调节区可操作地连接。
[0025] 在一个实施方案中，检测沉默增强子活性的多核苷酸是来自除了拟南芥之外的物 种的SUPPRESSOR OF ddc(SDC)同系物的启动子区域。SDC的同系物可来自单子叶植物或 双子叶植物。SDC的同系物可选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、 大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。在另一实施方案中，将检测增强转录基因沉默的推定的沉默增 强子或多核苷酸是由高水平内源24nt SiRNA沉默的并重度甲基化的基因座的启动子区域。 在一个实施方案中，植物可操作启动子是单启动子、双同源启动子或者双异源启动子。在一 个实施方案中，植物可操作启动子是单或双35S CMV启动子。在一个实施方案中，3'序列 是TRV2的3'序列。在另外的实施方案中，3'调节区是polyA添加序列。在一个实施方案 中，polyA序列是NOS poly A序列。更有效地沉默靶基因的检测可以根据本领域熟知的方 法进行。这些方法包括但不限于RT_PCR、PCR、northern印迹分析、免疫测定和酶测定。针 对更有效沉默而检测的启动子区域的片段检测可以根据本文所述的方法进行。
[0026] 附图简述
[0027] 图1示出不同的截短的SDC启动子的示意图。
[0028] 图2a_2d示出气孔簇（stomata cluster)表型。图2a:野生型（WT)气孔模式。图 2b: pMA/PTMM植物中的气孔簇。图2c和2d: pBA/PSDC-PTMM植物中的气孔簇。
[0029] 图3示出TMM RNA水平的qPCR。数字表示不同的转化品系，具有集簇气孔表型的 品系以星号标不。
[0030] 图4a-4c示出内源TMM启动子的DNA甲基化模式图。图4a:通过亚硫酸氢盐处理 的DNA测序分析的内源性TMM启动子的区域。图4b和4c:在不同的转化品系中CG、CHG(H =A、C或T)和CHH类型的胞嘧啶的DNA甲基化水平（％)。
[0031] 图5a-5f示出在pBA/PSDC(-DR)-PTMM植物中TMM启动子和编码区上组蛋白H3修 饰模式。图5a:设计为扩增相应于上述TMM启动子和编码序列的DNA片段（大约IOObp) 的qPCR引物。图5b_5f:在TMM启动子和编码区中不同的H3修饰。检测三个品系的pBA/ PSDC(-DR)-PTMM植物。集簇的气孔表型在品系#4和9中观测到，但在品系#12中未观测 到。
[0032] 图 6a_6c 不出 PTMM-相关 siRNA 的 Northern 印迹。图 6a:烟草 N. benthemiana 转化的Northern印迹。图6b:拟南芥的pBA/PTMM稳定转化品系的Northern印迹。图6c: 拟南芥的pBA/PSDC(-DR) -PTMM稳定转化品系的Northern印迹。在图6c和6b中，样品c 是阳性对照。
[0033] 图7a-7c示出不同TGS植物中的小RNA分析。图7a:定位于TMM启动子区域的 sRNA的克隆数和大小分布。图7b: TMM启动子区域正负链中的小RNA分布。图7c:不同TGS 植物中的第一碱基分布。
[0034] 图8a-8d示出TMM启动子区域中小RNA的分布。图8a:pBA/PSDC(-DR)-PTMM植物 的TMM启动子区域上的小RNA的分布。图8b:pBA/PTMM植物的TMM启动子区域上的小RNA 的分布。图8c:pBA/PTMM-AS植物的TMM启动子区域上的小RNA的分布。图8d:pBA/PTMM-IR 植物的TMM启动子区域上的小RNA的分布。
[0035] 图9示出SDC启动子的表观基因组图。表观基因组图示出WT(Col-O)、metl、ddc 和rdd突变体中的DNA甲基化和小RNA水平。第一条线（从上数）示出SDC(AT2G17690. 1) ORF至其上游相邻ORF的区域。PSDC序列分为5个区域，称作A、B、C、TR和DR。第2-5条 线（从上数）示出三种类型（CG、CHG和CHH)的DNA甲基化水平。在DR(直接重复）区域， 在WT和met、rdd突变体中示出重度DNA甲基化，而在ddc突变体中则否。小RNA水平在第 6-9条线（从上数）中示出。小RNA在WT中的DR区域富集，但是在ddc突变体中消除。在 A区域，小RNA在rdd突变体中增加。
[0036] 图10示出Northern印迹，其示出不同的截短的SDC启动子序列促进的siRNA水 平。
[0037] 图Ila-Ild示出Northern印迹以证实区域A增强其它DNA片段相关的siRNA的产 生。图lla:Northern印迹不出区域A对PTMM-AS相关的siRNA产生的增强。图llb:Northern 印迹示出区域A对PCH42相关的siRNA产生的增强。图lie和IlchNorthern印迹结果示 出区域A对PFAD2相关的siRNA产生的增强。
[0038] 发明详述
[0039] 本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默（TGS)。更特别 地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效地沉默感兴趣的基因如 内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS在植物、植 物组织或植物细胞中更有效地降低内源基因表达的方法。
[0040] 除非另外定义，本文中使用的所有科技术语均具有本领域所属领域技术人员通常 理解的相同含义。
[0041] 术语"多核苷酸"、"核苷酸序列"和"核酸"根据相关语境，用于指核苷酸聚合物（A、 C、T、U、G等，或者天然发生的或人工核苷酸类似物），例如DNA或RNA，或者其表征，如字符 串等。指定的多核苷酸或互补多核苷酸可以从任何特定的核苷酸序列确定。
[0042] 当多核苷酸、多肽或其它成分与其正常关联的成分（其它蛋白质、核酸、细胞、合 成试剂等）部分或完全分开时，称其为"分离的"。当核酸或多肽是人工或工程化的，或者衍 生自人工或工程化蛋白质或核酸时，称其为"重组的"。例如，插入载体或者任何其它异源位 置中的多核苷酸，例如插入重组生物体的基因组中，由此其与通常在天然发现的多核苷酸 两侧的序列不结合，称其是重组多核苷酸。在体外或体内从重组多核苷酸表达的蛋白质是 重组多肽的一个实例。同样，天然未出现的多核苷酸序列，例如天然发生的基因的变体，是 重组的。
[0043] 术语"核酸构建体"或者"多核苷酸构建体"是指单链或