用于产生遗传上优质的动物的方法
【专利说明】用于产生遗传上优质的动物的方法
[0001] 发明背景 本发明的公开内容涉及用于动物生产的方法。更具体而言，所述公开内容涉及具有某 些需要的性状的动物的选择性的生产。
[0002] 选择遗传上优质的动物的传统方法一般涉及使两只动物繁殖并检验产生的子代 以鉴定用于普遍用途的最佳种畜。虽然此方法是可靠的，但它具有较大的缺点。例如，子代 检验从构想到完成一般花费若干年。传统方法还与高度的浪费和高成本相关，因为仅仅10% 的公牛被选为终产品。基因组选择技术的出现允许饲养员在比传统方法的年龄更早的年龄 鉴定遗传上优质的动物。例如，可在出生前的不同阶段进行各种分子检验以鉴定具有需要 的性状的子代。
[0003] 有若干实用的方法，用以改进选择具有重要性状的优质的雄性和雌性牛的过程。 这些方法包括，例如，（1)增加选择的准确性；（2)增加选择的强度；和/或（3)减少世代间 隔。世代间隔一般指当子代降生时母体的平均年龄。世代间隔是在育种计划中影响遗传进 展速率的最重要的因素。最短可能的世代间隔是性成熟年龄和世代长度的总和。许多技术 可用于规避由世代间隔强加的限制。例如，先进的生殖技术例如从青春期前的幼年小母牛 取出卵、体外受精（IVF)和对产生的胚胎进行全基因组评价，已经用于缩短世代间隔。
[0004] 尽管自青春期前的小母牛的卵母细胞采集可用于缩短世代间隔，但以这样的方式 采集的卵母细胞的质量通常差，并趋向于产生低质量胚胎。大部分的全基因组分析需要通 过胚胎活检采集胚胎的一些胚胎细胞，所述胚胎活检可以是侵入性的并可损害胚胎的发育 潜力。此外，活检样本的全基因组分析可花费数星期，这需要在知道全基因组分析的结果之 前冷冻胚胎或将胚胎转移到受体。
[0005] 发明概述 本发明提供用于选择具有需要的性状的胚胎的改进的方法。在一个实施方案中，公开 了扩充胚胎的细胞数量用于基因组评价和子代产生的方法。
[0006] 因为冷冻正在发育的胚胎影响产仔效率，胚胎通常被新鲜地（即，不冷冻）转移至 受体动物用于子代的产生。在体外受精（IVF)之后通常将胚胎体外培养约7天。当在此阶 段将胚胎转移至同步化的受体时，每个胚胎一般含有约100 - 200个细胞。具有这种类型 的胚胎转移的产仔效率是大约40%，并且从这些子代获得优质的动物的速度是非常低的。在 本文中公开用于体外培养胚胎的改进的方法以帮助解决此问题。更具体而言，可将用于体 外培养胚胎的时间延长一个星期、两个星期、三个星期、一个月或更长以扩充每个胚胎中的 细胞数量（图1)。
[0007] 因此，在一方面中，本发明的特征在于用于在哺乳动物中选择遗传上需要的性状 的方法。该方法可包括以下步骤：(a)体外培养胚胎，其中在步骤（a)开始时所述胚胎包含 1-约500个细胞(例如，约100-约200个细胞，例如，约150-约200个细胞）；(b)将步骤 (a)的胚胎分成两个或更多个等分部分；（c)对步骤（b)的所述两个或更多个等分部分的至 少一个进行遗传分析；和（d)基于从步骤（c)中获得的结果选择来自步骤（b)的一个或多 个等分部分，其中所述选择的一个或多个等分部分携带遗传上需要的性状。
[0008] 在一个实施方案中，在步骤（a)之后，所述方法可包括将胚胎（即，体外培养的胚 胎)转移入雌性受体。在一些实施方案中，在约10-40天之后(例如，在转移后约10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39或40天后）自所述雌性受体采集胚胎。在一些实施方案中，在转移后约21 - 26天 之后自所述雌性受体采集所述胚胎。在一些实施方案中，在转移后约21天之后自所述雌性 受体采集所述胚胎。在其它实施方案中，在转移后超过40天的时期之后自所述雌性受体采 集所述胚胎。
[0009] 在另一实施方案中，所述方法另外包括步骤（e):使用来自步骤（d)的选择的等分 部分的一个或多个细胞以产生遗传上优质的哺乳动物。在一些实施方案中，步骤（e)包括 核转移步骤。在一些实施方案中，所述方法另外包括步骤（f):将没有经历遗传分析的上面 步骤（c)的等分部分冷冻。在另一方面中，所述方法还可包括步骤（g):将步骤（f)的冷冻 等分部分/胚胎解冻。
[0010] 在另一实施方案中，在受精后可将胚胎用改良的组织培养基(例如，无任何饲养细 胞)在一个或多个多孔板中单独在体外培养两个星期或更久。在此阶段，胚胎可以附着于组 织培养板的表面并且每个孔可含有数千个细胞。在一个实施方案中，这些细胞可以通过酶 的处理(例如，胰蛋白酶消化）被分成若干部分。所述分开的部分可被冷冻于若干个小瓶中 并保存在液氮里。
[0011] 在一个实施方案中，在冷冻之前可使一个部分的细胞经历遗传检验。在另一实施 方案中，在经历遗传检验之前所述部分的细胞可被冷冻和解冻。遗传检验的结果可用于确 定是否进一步继续来自相同胚胎的剩余部分的冷冻细胞。在一个实施方案中，如果来自遗 传检验的结果表明胚胎具有某些需要的遗传性状，则剩余细胞可用于使用标准的核转移技 术产生子代，所述子代会很可能表现出这种表型。
[0012] 在一个实施方案中，用于步骤（a)的培养基可含柠檬酸三钠、肌醇和氨基酸(例 如，SOFaaci)，所述培养基补充有15%胎牛血清。在另一实施方案中，用于步骤（a)培养基是 胚胎细胞培养基（EC1)。在一个实施方案中，ECl用于培养细胞直到细胞附着于板。在另一 实施方案中，ECl可含有50%的标准合成的输卵管流体（SOF，例如，SOFaaci)培养基和50% 的组织培养基，其含有补充有0.1% (v/v) 2-巯基乙醇、1% (v/v)非必需氨基酸、1% (v/v) ITS (10 μg/ml胰岛素、5.5 μg/ml转铁蛋白和6.7 ng/ml硒）、5 ng/ml人白血病抑制因 子、10 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、10 ng/ml人表皮生长因子、0.5%青霉素-链霉素 溶液和20%胎牛血清的D-最低必需培养基（D-MEM)。
[0013] 在另一实施方案中，在细胞附着于板之后可以使用用于维持培养的胚胎细胞培养 基（EC2)。在一个实施方案中，EC2可含有D-MEM，其补充有0. 1% (v/v) 2 -巯基乙醇、1% (v/v)非必需氨基酸、1% (v/v) ITS (10 μ g/ml胰岛素、5.5 μ g/ml转铁蛋白和6. 7 ng/ml 硒)、5 ng/ml人白血病抑制因子、10 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、10 ng/ml人表皮生 长因子、0. 5%青霉素-链霉素溶液和20%胎牛血清。
[0014] 在另一实施方案中，冷冻培养基可以是含有20%二甲亚砜（DMSO)和40%-80%的 FCS的EC2。例如，可将200 μ 1的DMSO和600 μ 1的FCS加入1ml的EC2以形成冷冻培养 基。
[0015] 在另一实施方案中，在步骤（a)开始时步骤（a)的胚胎可含有约100 -约200个 细胞。在另一实施方案中，在步骤（a)结束时胚胎可含有约300 -约600个细胞。在另一 实施方案中，在步骤（a)结束时胚胎可含有约400 -约800个细胞。
[0016] 在另一方面中，本发明的特征在于用于在哺乳动物中选择遗传上需要的性状的方 法，其包括以下步骤：(a)从多个胚胎的每一个取出一个或多个细胞；(b)培养所述一个或 多个细胞约2-6天；和（c)使步骤（b)的培养细胞经历遗传分析；(d)在取出所述一个或多 个细胞之后培养步骤（a)的多个胚胎；和（e)基于从步骤（c)中获得的结果自步骤（d)的 多个胚胎选择一个或多个胚胎，其中所述选择的一个或多个胚胎具有发展成携带所述遗传 上需要的性状的哺乳动物的潜力。
[0017] 在一个实施方案中，当所述多个胚胎在受精后约2天-约6天的年龄时进行步骤 (a) 〇
[0018] 在另一实施方案中，所述方法另外包括步骤（f):将步骤（d)的胚胎冷冻。在另一 实施方案中，所述方法另外包括步骤（g):将步骤（f)的冷冻胚胎解冻。
[0019] 在另一实施方案中，在步骤（a)期间将胚胎培养在包含约15% FCS的培养基中。
[0020] 在以上方面任意一项的实施方案中，在IVF之后将胚胎体外培养至少约5天(例 如，至少约5、6、7、