广食性丝胶家蚕品系及其建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种广食性丝胶家蚕品系及其建立方法，所述广食性丝胶家蚕品系即 使用桑叶含有率低的人工饲料也可进行全幼虫期的饲养。
【背景技术】
[0002] 多数家蚕（Bombyx mori)的饲养容易，与大肠杆菌等细菌相比，可在短期合成大 量的蛋白质，因此作为生产重组蛋白质等物质的宿主是有用的生物。在使用家蚕生产作 为目标的重组蛋白质的情况下，已知有使其在生产蚕丝的丝腺内合成的方法（非专利文献 1-3)。丝腺因大型而容易摘除，而且，将合成的蛋白质储藏在中部丝腺内腔中，因此，对于回 收目标重组蛋白质也很适宜。但是，在中部丝腺中通常蓄积有大量的构成蚕丝的纤维蛋白 即蚕丝蛋白。该蚕丝蛋白由于具有粘弹性，因此成为回收重组蛋白质时的抑制因素（非专 利文献4)。因此，丝胶家蚕品系适合用于重组蛋白质生产。丝胶为与蚕丝蛋白一同构成蚕 丝的蛋白质之一，为层状包被蚕丝蛋白的明胶样蛋白质。通常家蚕的茧由约75重量％的蚕 丝蛋白和约25重量％的丝胶构成。上述的丝胶家蚕品系由于在蚕丝蛋白的合成通路产生 突变，因此为可正常地合成丝胶但几乎无法合成蚕丝蛋白的突变种。因此，丝胶家蚕品系通 常无法形成茧而在裸蛹状态下蛹化。在这样的丝胶家蚕品系中，迄今已知有归因于3个不 同的基因的品系。可以通过使用该品系来解决基于上述蚕丝蛋白的问题。
[0003] 但是，在将家蚕用作生产重组蛋白质的宿主的情况下，在其重组蛋白质中最期望 看到的物质为医药品。在用家蚕生产医药品的情况下，建立可保证品质的稳定性的饲养过 程，同时要求完全的饲养上的管理及卫生上的管理。因此，使用无菌人工饲料的饲养不可欠 缺。另外，为了降低医药品的制造成本，需要在要求大量饲料的4~5龄幼虫期用低成本 的人工饲料饲养。通常桑叶含有率越低，市售的人工饲料越廉价。
[0004] 但是，上述丝胶家蚕品系均存在桑叶含有率低的人工饲料的摄食性差这样的大问 题（非专利文献5及6)。
[0005] 现有技术文献 [0006] 专利文献
[0007] 专利文献1 :日本专利第3374177号 [0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献 I :0gawa S.，et al.，2007, J Biotechnol, 128:531-544.
[0010] 非专利文献 2 :Tomita Μ·，et al.，2003, Nat Biotechnol，21:52-56.
[0011] 非专利文献 3 :Tomita Μ·，et al.，2007, Transgenic Res 16:449-465.
[0012] 非专利文献 4 :Kataoka K. &Uemat su I. , 1977, Kobunshi Ronbunshu(Japanese), 34 ;7_13·
[0013] 非专利文献 5 :Yamamoto Τ· , et al. , 2003. Bio Industry, Vol. 20, No. 2PP13-18.
[0014] 非专利文献 6 :Mase Κ·，et al.，2006, Insect Biotechnology and Sericology75, 85-88.
【发明内容】
[0015] 发明所要解决的课题
[0016] 本发明的课题在于，提供一种在丝胶家蚕品系中建立具有用桑叶含有率低的人工 饲料可进行全幼虫期饲养的性质的广食性家蚕品系的方法及其广食性丝胶家蚕品系。
[0017] 用于解决课题的技术方案
[0018] 为了解决上述课题，本发明人等尝试使用丝胶家蚕品系之一的营茧性丝胶家蚕品 系（Sericin-hope家蚕品系）（专利第3374177号、非专利文献2及3)建立即使用桑叶 含有率低的人工饲料也可饲养的广食性丝胶家蚕品系。但是，Sericin-hope家蚕品系为 在本来无法营茧的丝胶家蚕品系中具有可营茧这样的特殊特征的家蚕品系。因此，即使可 通过与广食性家蚕品系交配使遗传的平衡打破获得广食性，也会产生营茧性及蛹化性丧 失这样的新问题。本发明人等将Sericin-hope家蚕品系与广食性家蚕品系交配后，回交 Sericin-hope家蚕品系，结果，成功地建立了维持营茧性及高化蛹率的广食性丝胶家蚕品 系。在现有育种方法中，在基础品系中引入目标特征（在此为广食性）的情况下，与具有不 符合该目的的特征的品系交配的方法伴随获得的目标特征不稳定化的风险，因此，在该领 域中无法作为技术常识进行。但是，在本发明中，通过违背该技术常识将营茧性丝胶家蚕品 系（Sericin-hope品系）用于交配而成功有效地建立了营苗性广食性丝胶家蚕品系。本发 明是基于该建立方法而完成的，提供以下内容。
[0019] (1) 一种广食性丝胶家蚕品系的建立方法，其包括：(a)第一交配工序，将在至少1 个参与蚕丝蛋白合成通路的基因中具有突变的丝胶家蚕品系与广食性家蚕品系交配；(b) 第二交配工序，将第一交配工序后的杂交个体与所述或其它广食性家蚕品系交配至少2 次；及（c)广食性丝胶家蚕选择工序，进行5次以上的品系内交配，选择具有丝胶家蚕品系 的特征及广食性家蚕品系的特征的个体。
[0020] (2)如⑴所述的建立方法，其中，所述基因的突变为显性突变。
[0021] (3)如⑵所述的建立方法，其中，所述基因为NcUNd-S或Nd-sD。
[0022] (4)如（1)-(3)中任一项所述的建立方法，其中，所述丝胶家蚕品系为每1只具有 50mg以上的吐丝量的营茧性丝胶家蚕品系。
[0023] (5)如⑷所述的建立方法，其包括：(d)营茧性交配工序，将所述第二交配工序后 的杂交个体与所述或其它营茧性丝胶家蚕品系交配至少1次；及（e)营茧性广食性丝胶家 蚕选择工序，在营茧性交配工序后的广食性丝胶家蚕选择工序中，进一步选择具有营茧性 的个体。
[0024] (6)如（1)-(5)中任一项所述的建立方法，其还包括：（f)选择所述突变基因的纯 合体的工序。
[0025] (7) -种广食性丝胶家蚕品系及其后代，其在至少1个参与蚕丝蛋白合成通路的 基因中具有突变。
[0026] (8)如（7)所述的广食性丝胶家蚕品系及其后代，其是通过以下得到的：将在至少 1个参与蚕丝蛋白合成通路的基因中具有突变的丝胶家蚕品系与广食性家蚕品系交配所得 到的杂交个体，与所述或其它广食性家蚕品系交配至少2次；进而，基于丝胶家蚕品系的特 征及广食性家蚕品系的特征进行5次以上的品系内交配。
[0027] (9)如⑶所述的广食性丝胶家蚕品系及其后代，其中，所述基因的突变为显性突 变。
[0028] (10)如（9)所述的广食性丝胶家蚕品系及其后代，其中，所述基因为NcU Nd-s或 Nd-S110
[0029] (11)如（7)-(10)中任一项所述的广食性丝胶家蚕品系及其后代，其中，所述丝胶 家蚕品系为每1只具有50mg以上的吐丝量的营茧性丝胶家蚕品系。
[0030] (12)如（11)所述的广食性丝胶家蚕品系及其后代，其是在将所述杂交个体与所 述或其它广食性家蚕品系交配至少2次后，与所述或其它营茧性丝胶家蚕品系交配至少1 次所得到的，且具有营茧性。
[0031] (13)如（7)-(12)中任一项所述的广食性丝胶家蚕品系及其后代，其为所述突变 基因的纯合体。
[0032] (14) -种将（7)-(13)中任一项所述的广食性丝胶家蚕品系或其后代用作生产物 质的宿主，以在该家蚕品系的丝腺内制造重组肽的方法。
[0033] 本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2012-235259号的说 明书及/或附图中所记载的内容。
[0034] 发明效果
[0035] 根据本发明的广食性丝胶家蚕品系建立方法，可以建立具有丝胶家蚕品系和广食 性家蚕品系两者的特征的广食性丝胶家蚕品系。
[0036] 根据本发明的广食性丝胶家蚕品系，可以提供一种可用桑叶含有率低的人工饲 料饲养全幼虫期的广食性丝胶家蚕品系。
[0037] 根据本发明的制造重组肽的方法，可以以本发明的广食性丝胶家蚕品系为生产物 质的宿主，在短期大量地制造重组蛋白质。
【附图说明】
[0038] 图1是示出通过本发明的建立方法将营茧性丝胶家蚕品系和广食性家蚕品系交 配所得到的广食性丝胶家蚕品系个体中的桑叶低含有率人工饲料的摄食率的变化的图；
[0039] 图2是示出通过本发明的建立方法将营茧性丝胶家蚕品系和广食性家蚕品系交 配所得到的广食性丝胶家蚕品系个体中的营茧率的变化的图；
[0040] 图3是示出通过本发明的建立方法将营茧性丝胶家蚕品系和广食性家蚕品系交 配所得到的广食性丝胶家蚕品系个体中的化蛹率的变化的图；
[0041] 图4是使用了本发明的建立方法的营茧性广食性丝胶家蚕品系MNS300的建立流 程；
[0042] 图5是使用了本发明的建立方法的营茧性广食性丝胶家蚕品系MCS300的建立流 程；
[0043] 图6是示出使用本发明的广食性丝胶家蚕品系制造重组肽EGFP时的每一个体的 EGFP 表达量的图。A 表示 MNS300X (Serl-Gal4XUAS-EGFP)、B 表示（MNS300XMCS300) X ( Serl-Gal4XUAS-EGFP)、及 C 表示 Sericin-hopeX (Serl-Gal4XUAS-EGFP)。
【具体实施方式】
[0044] 下面，对本发明的【具体实施方式】进行说明。
[0045] 1.广食性丝胶家蚕品系的建立方法
[0046] 1-1.概要
[0047] 本发明的第一实施方式为广食性丝胶家蚕品系的建立方法。根据本发明的建立 方法，可以建立兼备丝胶家蚕品系和广食性家蚕品系两者的特征的广食性丝胶家蚕品系。
[0048] 1-2.建立方法
[0049] 本发明的建立方法包括第一~第二交配工序及广食性丝胶家蚕选择工序作为必 需工序，进而，可以包括营茧性交配工序及营茧性广食性丝胶家蚕选择工序、以及纯合体选 择工序作为可选工序。下面，对各工序进行具体说明。
[0050] (1)第一交配工序
[0051] "第一交配工序"为将广食性家蚕品系和丝胶家蚕品系交配的必需工序。
[0052] 在本说明书中，"家蚕品系"是指具有特定特征的家蚕的突变种。
[0053] 在本说明书中，"广食性（家蚕品系）"是指不仅是含有桑属（Morus)的叶（以下， 在本说明书中设为"桑叶"）的人工饲料，即使用不含桑叶的人工饲料或桑叶含有率低的人 工饲料也可摄食，且可饲养全幼虫期的家蚕品系。
[0054] 需要说明的是，关于摄食性，