作为植物害虫特别是鳞翅目和双翅目的生物防治剂的侧孢短芽孢杆菌的新菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillius Iaterosporus)的新菌株，以及含 有该菌株的组合物，还提供了使用该新菌株及组合物生物防治昆虫害虫包括小菜蛾和蚊子 的方法。
【背景技术】
[0002] 昆虫害虫代表着现代农业显著的经济成本，目前的农业系统通常需要一种或几种 作物或植物类型以进行大面积生长。这种不平衡的生态系统容易受到昆虫的压力。
[0003] -些昆虫害虫也会危害动物包括人类的健康，例如，已知蚊子会携带多种疾病。因 此，它们会作为疾病传播的载体。
[0004] 传统上，昆虫害虫的防治一直追求杀虫剂（insecticide)和农药（pesticide)的 使用。然而，消费者越来越关心化学残留物以及它们对动物和植物健康以及环境的影响。此 外，很多昆虫害虫变得耐农药和杀虫剂。
[0005] 生物防治代表着一种防治昆虫害虫的替代方法，以减少对化学品的依赖。这种"天 然"方法比化学防治方法更容易被公众接受，且更有效和更可持续。
[0006] 已经研宄了包括细菌、酵母和真菌的范围广泛的生物防治剂在防治昆虫害虫中的 应用。一种广泛研宄的杀虫用细菌种类是芽孢杆菌。
[0007] 芽孢杆菌是一个包括具有从对动物和植物健康有害到对昆虫防治有好处而变化 的性质的许多不同细菌种类的属。
[0008] 特别地，苏云金芽孢杆菌（Bt基因）是一个众所周知的生物防治剂，可商购的产 品如 Thuricide?和 Dipel?。
[0009] 近年来已经出现了昆虫对Bt发展的抗性的证据，请参阅例如Tabashnik等 (1990) ;Baxter等（2011);和Tabashnik等（1998)。因此，仍然需要一种用于防治害虫（包 括昆虫害虫）的新芽孢杆菌种类。
[0010] 本发明的申请人现在已经确定了一些作为生物防治剂有效的新侧孢短芽孢杆菌。
[0011] 因此，本发明的一个目的是提供作为生物防治剂有用的侧孢短芽孢杆菌新菌株， 另一个目的是提供含有至少一种本发明的新的侧孢短芽孢杆菌菌株的组合物；和/或至少 为公众提供一种有用的选择。
【发明内容】
[0012] 一方面，本发明提供了一种对至少一个鳞翅目种类和至少一个双翅目种类具有杀 虫活性的分离的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0013] 在一种实施方式中，至少一个鳞翅目种类是小菜蛾（diamondback moth，Plutella xylostella)〇
[0014] 在一种实施方式中，至少一个鳞翅目种类是甘蓝尺蠖蛾（cabbage looper moth， Trichoplusia ni)〇
[0015] 在一种实施方式中，至少一个鳞翅目种类选自卷蛾科和菜蛾科。
[0016] 在另一种实施方式中，至少一个双翅目种类是蚊种类。
[0017] 在另一种实施方式中，蚊种类选自库蚊（Culex pervigilans)和棕色造物主 (Opifex fuscus) 〇
[0018] 在另一种实施方式中，侧孢短芽孢杆菌菌株对小菜蛾（Plutella xylostella)和 选自库蚊（Culex pervigilans)和棕色造物主（Opifex fuscus)的至少一种蚊种类都有活 性。
[0019] 在一种实施方式中，侧孢短芽孢杆菌菌株是生物纯培养物的形式。
[0020] 分离的侧孢短芽孢杆菌菌株或生物纯培养物可选自菌株NMI No. V12/001946,NMI N〇.V12/001945 和 NMI N〇.V12/001944。
[0021] 一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌菌株NMI No. V12/001946的生物纯培养物。
[0022] 另一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌菌株匪I NO.V12/001945的生物纯培养 物。
[0023] 另一方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌菌株匪I NO.V12/001944的生物纯培养 物。
[0024] 另一方面，本发明提供了一种含有至少一种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株以及农 业上可接受的载体的组合物。
[0025] 在一种实施方式中，本发明提供了含有一种或多种选自匪I No. V12/001946,匪I No. V12/001945和NMI No. V12/001944的侧孢短芽孢杆菌菌株以及农业上可接受的载体的 组合物。
[0026] 在一种实施方式中，所述组合物可含有两种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株。在另 一种实施方式中，所述组合物可含有三种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0027] 在一种实施方式中，所述组合物基本上由一种或多种选自匪I No. V12/001946、 NMI No. V12/001945和NMI No. V12/001944的侧孢短芽孢杆菌菌株和农业上可接受的载体 组成。
[0028] 在一种实施方式中，所述组合物基本上由两种本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株和农 业上可接受的载体组成。在另一种实施方式中，所述组合物基本上由三种本发明的侧孢短 芽孢杆菌菌株组成。
[0029] 在一种实施方式中，所述组合物为杀虫剂组合物。
[0030] 另一方面，本发明提供了一种用于防治至少一种害虫的方法，该方法包括用本发 明的组合物接触至少一种害虫。
[0031] 另一方面，本发明提供了一种用于防治至少一种害虫的方法，该方法包括用本发 明的一种或多种侧孢短芽孢杆菌菌株接触至少一种害虫。
[0032] 优选地，所述至少一种害虫为昆虫害虫，更特别地，所述至少一种害虫选自鳞翅目 和双翅目。
[0033] 所述菌株的应用，本发明方法中的本发明的菌株或组合物可防治一种以上类型的 害虫。
[0034] 因此，在另一种实施方式中，所述至少一种害虫为昆虫害虫，选自鳞翅目、双翅目 中的一种或两种。
[0035] 在一种实施方式中，所述至少一种昆虫害虫选自小菜蛾和蚊子。
[0036] 在另一种实施方式中，所述至少一种害虫为选自小菜蛾、蚊子中的一种或两种的 昆虫害虫。
[0037] 在一种实施方式中，鳞翅目选自卷蛾科（Tortricidae)、菜蛾科（Plutellidae)和 夜蛾科（Noctuidae)。在一种具体的实施方式中，鳞翅目选自卷蛾科和菜蛾科。
[0038] 在另一种实施方式中，所述至少一种昆虫害虫是蛾。在一种实施方式中，所述 蛾选自由小菜蛾（Plutella xylostella)、甘蓝尺蠖蛾（Trichoplusia ni)、苹果蠹蛾 (Cydia pomonella)、普通森林尺蠖蛾（Pseudocoremia suavis)、棉铃虫蛾（Helicoverpa armigera)、苹果浅褐卷叶蛾（Epiphyas postvittana)、黑腿稻纵卷叶螟蛾（Planotortrix notophaea)和黑琴稻纵卷叶螟（black lyre leafroller，Cnephasia jactatana)组成的 组。
[0039] 在另一种实施方式中，所述害虫为线虫。在一种具体的实施方式中，所述线虫为微 虫（microworm)。优选地，所述微虫为全齿复活线虫（Panagrellus redivivus)。
[0040] 在另一种实施方式中，所述昆虫害虫为胡蜂（wasp)。在一种具体的实施方式中，所 述胡蜂为普通黄胡蜂（Vespula vulgaris)。
[0041] 在另一种实施方式中，所述昆虫害虫为麦卢卡甲虫（Pyronta sp.)。
[0042] 定义
[0043] 本文所用的术语"杀虫剂"是指作用为杀死或防治昆虫生长的药剂。
[0044] 本文所用的术语"接触"是指以一种对有效的害虫防治有用的方式将本发明的组 合物或菌株提供给害虫。最普遍的接触将会涉及将含有本发明的组合物或菌株的材料对害 虫喂食，但不限于此。因此，接触包括喂食。
[0045] 本文可互换使用的术语"防治（control) "，"防治中（controlling) "，"生物防治 (biocontrol) "或"生物的防治（biological control) "是指使用本发明的菌株或组合物 以实现害虫特别是昆虫害虫的数量的减少。一般理解的是数量上的减少，或害虫的消灭，或 它们繁殖率的抑制。
[0046] 本说明书中所用的术语"含有（comprising) "意思是"由至少部分组成 (consisting at least in part of)"，当解释说明书中包括术语"含有（comprising)" 的 每个语句时，除了由该术语开头的那些特征也可以存在。相关术语例如"含有（comprise)" 和"含有（comprises) "，以及术语"包括（including) "，"包括（include) "和"包括 (includes) "也以相同的方式解释。
[0047] 当术语"基本上由……组成"用在本说明书中时，该术语是指确定的特征且允许不 实质上改变所指定的特征的基本特性的其它特征的存在。
[0048] 术语"农业上可接受的载体"涵盖了本领域中所有已知的液体和固体载体，例如水 和油，以及佐剂、分散剂、粘合剂、湿润剂（wettants)、表面活性剂、保湿剂、增粘剂等，它们 是已知常规的用于在防治组合物（包括杀虫剂组合物）的制备中应用的。
[0049] 本文中所用的术语"有效量"的意思是对防治或消灭害虫（特别是昆虫害虫）起 作用的用量。
[0050] 本文所用的术语"生物纯培养物"或者"生物纯分离物"是指含有至少90 %，优选 为95 %，优选为99 %，更优选为至少99. 5 %的侧孢短芽孢杆菌菌株细胞的本发明的侧孢短 芽孢杆菌菌株的培养物。
[0051] 本文所用的术语"害虫"是指给人类带来不便的有机体。在一种实施方式中，该术 语是指对动物（包括人类），或植物造成伤害的有机体。该伤害可涉及植物或动物健康、生 长、产量、繁殖或生存能力（viability)，且可以是表面的伤害（cosmetic damage)。优选地， 该伤害是商业上显著的。在一种优选实施方式中，术语"害虫"是指对植物造成伤害的有机 体。优选地，该植物为栽培植物。
【具体实施方式】
[0052] -方面，本发明涉及具有杀虫（包括昆虫害虫以及特别是鳞翅目和双翅目）活性 的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0053] 侧孢短芽孢杆菌是一种形成昆虫病原细菌的需氧孢子，已知其对一些昆虫种类是 致病的。像苏云金芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌的特征在于孢子囊裂解后，在孢子的一侧上产 生的典型的独木舟状类芽孢体（CSPB)的制剂。
[0054] 侧孢短芽孢杆菌已被记录为目标寄生线虫（Bone and Singer, 1991 ;Huang et al·，2005 ;Singer, 1996)、软体动物、鞘翅目（Boets et al·，2004 ;Schn印f et al·，2003; Singer, 1996;Singer et al.，1997)、双翅目（Favret and Yousten，1985;Rivers et al.，1991)和鱗翅目黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis) (De Oliveira et al.，2004)的卵 和幼虫的病原体。不同的毒力因子已被记录在不同的侧孢短芽孢杆菌菌株间（Favret and Yousten, 1985 ；Rivers et al. , 1991 ；Zahner et al.，1999)〇
[0055] Orlova等（1998)在对双翅目种类（包括黄热病蚊子Aedes aegypti)的幼虫 的生物检测中首次证明了侧孢短芽孢杆菌的毒性活性与它的孢子和晶体的相关性。这 种蚊子可作为黄热病和其它疾病如登革热和切昆贡亚热（Chikungunya)的载体。对黑 幡（Simulium vittatum)、蚊子（Culex quinquefasciatus 和 Aedes aegypti) (Favret 和 Yousten, 1985 ;Rivers et al·，1991)，和家幡（Musca domestica(Ruiu et al. 2006))， EP2, 079, 314的幼虫的活性也已有报道。
[0056] 侧孢短芽孢杆菌对鞘翅目种类的活性首次在初步生物检测中进行了报 道，该种类包括烟草甲虫Lasioderma serricorne和科罗拉多甲虫Leptinotarsa decemlineata(Rivers et al.，1991)。不同侧抱短芽抱杆菌菌株对玉米根虫（Diabratica spp.)的活性已有报道（Aronson et al.，1991 ;Schnepf et al.，2002 ;Boets et al.，2011)。玉米根虫是玉米作物的主要的农业害虫。
[0057] De Oliveira等（2004)报道了对墨西哥棉铃象甲Anthonomus grandis (与粮食伤 害相关的害虫）的高毒性，在相同的研宄中也报道了对黎豆毛虫Anticarsia gemmatalis 的鳞翅类的活性。
[0058] 然而，迄今为止没有任何报道来讨论菌株对双翅目和鳞翅目的活性。Rivers等 (1991)筛选了 28株针对毛虫、蚊子和鞘翅目（马铃薯甲虫）的菌株，发现对毛虫没有活性， 但对其它两个组有活性。Favret和Yousten (1985)也发现对蚊子有活性，但是对鞘翅目没 有活性。
[0059] 令人惊讶的是，申请人现在已经确定了对一系列昆虫害虫（包括一些鳞翅目和双 翅目）具有活性的侧孢短芽孢杆菌菌株。特别地，已从甘蓝种子和新西兰土壤中分离出 来了三种细菌，侧孢短芽孢杆菌的菌株。筛选检测显示这三种菌株对小菜蛾幼虫，小菜蛾 Plutella xy