用于治疗和控制植物病害的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于治疗和控制植物病害的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年10月19日提交的美国临时申请号61/716, 245和于2013 年3月14日提交的美国临时申请号61/785,535的权益，二者通过引用完全结合于此。
[0003] 关于联邦政府资助的研宄的声明
[0004] 依照下述，美国政府享有本发明的某些权利：动植物卫生检验局（APHIS)关于 德克萨斯皮尔斯疾病研宄与教育项目（Texas Pierce' s Disease Research&Education Program)的合作协议奖，协议号为11-8500-0955-CA，授予AgriLife研宄；和Otsuka制药 有限公司（Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD)，协议号为 406039,授予 AgriLife 研宄。
[0005] 序列表的并入
[0006] 命名为"TAMC019W0_ST25. txt"的文件中所包含的序列表以电子形式提交并且通 过引用结合在本文中，该文件在Microsoft Windows操作系统中测量为907kb，并且是在 2013年10月17日生成的。 发明领域
[0007] 本发明涉及植物病理学领域。更具体地，本发明涉及用于分离噬菌体和用于治疗 由苛养木杆菌（Xylella fastidiosa)和地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis)引起 的植物病害的方法和组合物，包括作为细菌病毒的噬菌体的应用。
[0008] 发明背景
[0009] 在植物中，细菌可能引起多种病害，包括葡萄藤的皮尔斯病（Pierce' s Disease) 和柑橘属植物的柑橘溃疡（Citrus Canker)。细菌感染植物组织，并且可能引起萎蔫、生长 差、损害果实，甚至是植物死亡。感染可能通过风、雨、被污染的设备或媒介昆虫传播而发 生，其迅速地传播到其他植物上，并且导致对所述植物的有害的作用和大量的农作物损失。 这些病害的有效治疗需要一种治疗植物消除细菌的方法。
[0010] 发明概述
[0011] 在一方面，本发明提供繁殖其宿主范围包括苛养木杆菌（X. fastidiosain)的有 毒菌体（bacteriophage或phage)的方法，所述方法包括用所述·菌体感染黄单胞菌属 (Xanthomonas)细菌的培养物，允许所述噬菌体繁殖，并且从所述培养物中分离噬菌体颗 粒。在另一个实施方案中，所述黄单胞菌属细菌包括物种菌株EC-12。在另一个实施方案 中，所述噬菌体通过结合细胞表面特征而感染细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表面特 征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述菌体包括来自由podophage、siphophage和 myophage组成的组的有尾噬菌体。在其他实施方案中，所述噬菌体是从环境、污水处理厂或 流出物、植物或其表面或从环境土壤中分离的。在本发明的其他实施方案中，利用替代宿主 (surrogate host)来富集有毒菌体。在另一个实施方案中，所述菌体对苛养木杆菌有 毒。在其他实施方案中，利用琼脂覆盖（agar overlaying)来生长所述·菌体。
[0012] 在另一方面，本发明提供获得用于皮尔斯病的候选生物控制剂的方法，所述方法 包括使苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌与包含有毒噬菌体群体的样品接触，并且从所述群体 分离至少第一种能够裂解所述苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌的噬菌体。在一个实施方案 中，所述噬菌体通过与细胞表面特征结合而感染细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表 面特征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述细胞表面特征是细菌宿主的发病机制/ 毒力所需要的。其他实施方案包括使苛养木杆菌和黄单胞菌属中的至少一种的菌苔与样 品接触，使苛养木杆菌和黄单胞菌属同时与样品接触，和使苛养木杆菌和黄单胞菌属先后 与样品接触。在其他实施方案中，所述噬菌体是从环境、污水处理厂或流出物、植物或其表 面或从环境土壤中分离的。在另一个实施方案中，所用的噬菌体是对苛养木杆菌（Xylella fastidiosa)有毒的。所述方法还包括在使宿主细菌与有毒噬菌体接触后，检测裂解的细菌 宿主细胞或噬菌斑的形成。在具体的实施方案中，所述方法包括其上已经引入了噬菌体样 品的平板琼脂覆盖物或细菌宿主细胞的平板。
[0013] 在其他实施方案中，使用含有苛养木杆菌和黄单胞菌属的软琼脂覆盖物来制备噬 菌体，并且在其他实施方案中，通过收集一种或多种包含表现出融合裂解的苛养木杆菌菌 株或黄单胞菌属菌株（如EC-12)的覆盖平板，然后浸离并通过离心来澄清，来制备高滴度 的噬菌体平板裂解物。滤器除菌后，可以保存得到的裂解物，例如，在4°C保存。随后，纯化 高滴度噬菌体裂解物，例如，通过等密度CsCl离心进行，并且将提取的噬菌体溶液进行透 析。得到的CsCl-纯化的噬菌体典型地展现出约lX10 nPFU/ml的滴度。
[0014] 在一些实施方案中，植物组织滤出液（PTFs)中的噬菌体比率约为ImlPTF :20ml替 代宿主（所选的宿主的活性生长培养物），对于苛养木杆菌菌株Temecula生长4天或对于 黄单胞菌属菌株EC-12生长4小时。
[0015] 本发明的另一方面提供预防或减少植物中与苛养木杆菌相关的症状或病害的方 法，所述方法包括使植物与其宿主范围包括苛养木杆菌的噬菌体接触，其中所述与苛养木 杆菌相关的症状或病害包括典型的皮尔斯病（PD)症状，其中叶片沿着边缘表现出黄色或 红色的现象，最终叶片边缘坏死。在一个实施方案中，可以将噬菌体颗粒引入到植物中。 在另一个实施方案中，所述植物选自由下述组成的组：葡萄藤植物，柑橘属植物，杏树属 (almond)，咖啡树，苜蓿（alfalfa)，夹竹桃（oleander)，栎属树（oak)，香楓（sweetgum)， 紫荆属（redbud)，榆树（elm)，桃树，杏树（apricot)，李属（plum)，黑莓，桑树（mulberry) 和梓柳（Chitalpa tashkentensis)。在另一个实施方案中，菌体通过注射、昆虫媒介 (insect vector)引入到植物中或通过注射经由根系统引入到植物中。在其他实施方案中， 注射包括针头或无针头系统、充气空气（pneumatic air)或压力注射系统。在其他实施方 案中，注射是手工进行的，或者一次，或者多于一次。在另一个实施方案中，所述昆虫媒介是 玻璃翅叶蝴（glassy winged sharpshooter)。在另一个实施方案中，要引入到植物中的· 菌体为1至l〇12PFU/ml (噬菌斑形成单位/ml)、IO4至10 11PFUAil和IO7至10 wPFUAil。在 另一个实施方案中，所述噬菌体颗粒通过下述方法获得：所述方法包括用所述噬菌体感染 黄单胞菌属细菌的培养物，允许所述噬菌体繁殖，并且从所述培养物分离噬菌体颗粒。在另 一个实施方案中，所述方法包括使植物群体与所述噬菌体颗粒接触，以预防或减少与苛养 木杆菌相关的症状。在另一个实施方案中，所述噬菌体包括选自下述Xfas 100噬菌体类型 或Xfas300 菌体类型的菌株中的至少一种菌体（bacteriophage或phage)。
[0016] 在另一方面，本发明提供一种配制递送至植物的植物病害生物控制组合物，所述 组合物包含至少一种稀释剂、辅药或表面活性剂，和至少一种来自下述XfaslOO噬菌体类 型或Xfas300 B莖菌体类型的菌体。在一个实施方案中，所述组合物进一步定义为配制用 于通过注射、喷洒（spraying)、薄雾（misting)或粉末（dusting)引入到植物中。在另一个 实施方案中，所述组合物进一步被定义为配制用于局部施用至植物。
[0017] 在另一方面，本发明提供获得用于柑橘属溃疡的候选生物控制剂的方法，所述方 法包括使地毯草黄单胞菌柑橘致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. citri)细菌与包含 有毒噬菌体群体的样品接触，并且从所述群体分离至少第一种能够裂解所述地毯草黄单胞 菌（Xanthomonas axonopodis)细菌的菌体。在一个实施方案中，所述菌体通过结合细 胞表面特征而感染细胞。在一个实施方案中，所述细胞表面特征是IV型菌毛。在另一个实 施方案中，所述细胞表面特征是细菌宿主的发病机制/毒力所需要的。其他实施方案包括 使黄单胞菌属的菌苔与样品接触。在另一个实施方案中，所用的噬菌体对地毯草黄单胞菌 有毒。
[0018] 本发明的另一方面提供预防或减少植物中与地毯草黄单胞菌相关的病害的方 法，所述方法包括使植物与其宿主范围包括地毯草黄单胞菌的噬菌体接触。在一个实 施方案中，可以将噬菌体颗粒引入到植物中。在一些实施方案中，所述植物是选自由柑 橘属（Citrus)物种、金桔属（Fortunella)物种、枳属（Poncirus)物种、酸橙（lime)、 梓檬（lemon)、橙子（orange)、葡萄柚（grapefruit)、柚子（pomelo)和用作站木的枸橘 (trifoliate orange)的杂交体组成的组柑橘属植物。在另一个实施方案中，菌体通过 注射、昆虫媒介引入到植物中或通过注射经由根系统引入到植物中。在一些实施方案中，注 射包括针头或无针头系统、充气空气或压力注射系统。在其他实施方案中，注射是手工进行 的，或者一次，或者多于一次。在另一个实施方案中，所述昆虫媒介是玻璃翅叶蝉。在另一 个实施方案中，要引入到植物中的噬菌体为1至l〇 12PFU/ml (噬菌斑形成单位/ml)、IO4至 10nPFU/ml和IO7至10 wPFUAil的浓度。在另一个实施方案中，所述方法包括使植物群体与 所述噬菌体颗粒接触，以预防或减少所述群体中与地毯草黄单胞菌及其致病变型相关的症 状。在另一个实施方案中，所述噬菌体包括选自下述XfaslOO噬菌体类型或Xfas300噬菌 体类型的菌株中的至少一种噬菌体。
[0019] 在另一方面，本发明提供对地毯草黄单胞菌Xfas303噬菌体有毒的分离的噬菌 体，其中所述噬菌体的代表性样品已经保藏，保藏号为ATCC登记号PTA-13099。在另一方 面，本发明提供对地毯草黄单胞菌和/或苛养木杆菌有毒的分离的噬菌体，如选自由下述 组成的组的一种噬菌体：Xfasl01，Xfasl02,Xfasl03,Xfasl04,Xfasl05,Xfasl06,Xfasl07， Xfasl08, Xfasl09, XfasllO, Xfas301，Xfas302, Xfas304, Xfas305 和 Xfas306,其中所述 噬菌体 Xfasl03、Xfasl06、Xfas302、Xfas303、Xfas304 和 Xfas306 的代表性的样品已经保 藏，保藏号为 ATCC 登记号 PTA-13095, PTA-13096, PTA-13097, PTA-13098, PTA-13099 和 PTA-13100。
[0020] 在特定的实施方案中，本发明提供预防或减少植物中与苛养木杆菌或地毯草黄单 胞菌柑橘致病变种（Xanthomonas axoxonopodis pv. Citri)相关的症状或病害或由苛养木 杆菌或地毯草黄单胞菌柑橘致病变种（Xanthomonas axoxonopodis pv. Citri)引起的症状 或病害的方法，所述方法包括使所述植物与有毒噬菌体接触的步骤，所述噬菌体在其宿主 范围内包括苛养木杆菌和/或地毯草黄单胞菌柑橘致病变种，进一步地，其中所述噬菌体 是选自由XfaslOO噬菌体类型和Xfas300噬菌体类型组成的组的至少一种噬菌体，其中所 述XfaslOO型噬菌体具有选自由下述组成的组的至少一个特征：(a)所述噬菌体能够裂解 所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌；(b)所述噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；（c) 所述噬菌体属于一组这样的有尾噬菌体，所述噬菌体展现出长的非收缩性的尾部，具有直 径在55-77mm范围内的衣壳，典型是管状病毒科（Siphoviridae)的形态；（d)所述菌体 的基因组大小为约55500bp至56200bp ;和（e)所述噬菌体预防或减少一种植物或多种植 物中与皮尔斯病相关的症状；并且其中所述Xfas300型噬菌体具有选自由下述组成的组的 至少一种特征：(a)所述噬菌体能够裂解所述苛养木杆菌和/或黄单胞菌属细菌；(b)所述 噬菌体通过结合IV型菌毛感染细胞；（c)所述噬菌体属于一组这样的有尾噬菌体，所述噬 菌体展现出短的非收缩性的尾部，具有直径在58-68mm范围内的衣壳，典型是短尾病毒科 (Podoviridae)的形态；（d)卩莖菌体的基因组大小为约43300bp至44600bp ;和（e)所述菌 体具有预防或减少一种植物或多种植物中与皮尔斯病相关的症状的活性。在特定的实施方 案中，向植物中引入单一类型的有毒噬菌体。在其他实施方案中，向植物中引入2、3、4、5、6 或更多种有毒噬菌体分离株或类型的组合，同时引入或先后引入。在特定的实施方案中，所 述噬菌体包含这样的基因组，所述基因组具有选自由SEQ ID NO :11-24组成的组的DNA序 列，或与其至少90%、95%、98%或99%相同的DNA序列。因此，在特定的实施方案中，要引 入到植物中的噬菌体选自由下述组成的组：Xfasl01，Xfasl02，Xfasl03，Xfasl04，Xfasl05， Xfasl06, Xfasl07, XfasllO, Xfas301，Xfas302, Xfas303, Xfas304, Xfas305 和 Xfas306。还 包括配置用于递送到植物中且包含所述XfaslOO和/或Xfas300型噬菌体的植物病害生物 控制组合物。所述生物控制组合物可以进一步包含载体。在一些实施方案中，所述载体可 以包含稀释剂、表面活性剂和/或缓冲剂。
[0021] 附图简述
[0022] 为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在结合附图参考本发明的详细描述， 在附图中：
[0023] 图1 :显示噬菌体Xfas302、Xfas303、Xfas304和Xfas305的TEM图像，所述噬菌体 具有短尾病毒科特有的形态和大小。
[0024] 图2 :显示噬菌体Xfasl01、Xfasl02、Xfasl03和XfasHM的TEM图像，所述噬菌体 具有管状病毒科特有的形态和大小。
[0025] 图3 :显示分离自废水的能够在XF15和EC-12上形成噬菌斑的苛养木杆菌的短尾 病毒科和管状病毒科噬菌体。
[0026] 图4 :显示管状病毒科Xfas 103和Xfas 106的基因组图谱。
[0027] 图5 :显示短尾病毒科Xfas302、Xfas303、Xfas304和Xfas306的基因组图谱。
[0028] 图6 :显示用菌株XF54接种后8周并且不用噬菌体攻击的表现出皮尔斯病症状的 葡萄藤植物。
[0029] 图7 :显示葡萄藤噬菌体治疗和预防性攻击研宄的总结。
[0030] 图8 :显示在噬菌体接种后8周（上图）和12周（下图）在接种的葡萄藤中个 体噬菌体的移动和存留。左图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线 (cordon) 1存在的噬菌体。右图：在葡萄藤的防疫线2存在的噬菌体。
[0031] 图9 :显示3周后在用噬菌体混合物（cocktail)攻击的接种的葡萄藤中XF15的 水平。在噬菌体混合物攻击后9周（细菌接种后12周）收集样品。左图：在根组织中存在 的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线1存在的噬菌体。右图：在葡萄藤的防疫线2存在的 噬菌体。灰色柱显示在XF15接种的葡萄树中的XF15水平。黑色柱显示在病原体接种后第 3周用噬菌体混合物攻击的XF15接种的葡萄树中的XF15水平。箭头显示具有接种点的节 段。每个柱表示3棵葡萄树的根和2个防疫线的平均CFU/gpt (克植物组织）。
[0032] 图10 :显示在初始用XF15接种并且3周后用噬菌体混合物攻击的葡萄藤中混合 噬菌体的水平。在噬菌体混合物攻击后5、7和9周（初始细菌接种后8、10和12周）收集 样品。左图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线1存在的噬菌体。右 图：在葡萄藤的防疫线2存在的噬菌体。黑色柱显示在混合物接种的植物中的噬菌体水平。 灰色柱显示在病原体接种后第3周用噬菌体混合物攻击的XF15接种的葡萄树中的噬菌体 水平。箭头表示具有接种点的节段。每个柱表示由3棵葡萄树的根和2个防疫线决定的混 合物中4种噬菌体的平均CFU/gpt (克植物组织）。
[0033] 图11 :显示在初始用噬菌体混合物接种并且3周后用XF15攻击的葡萄藤中的噬 菌体水平。在XF15攻击后5、7和9周（初始噬菌体接种后8、10和12周）收集样品。左 图：在根组织中存在的噬菌体。中间图：在葡萄藤的防疫线1存在的噬菌体。右图：在葡萄 藤的防疫线2存在的噬菌体。黑色柱显示在混合物接种的葡萄树中的噬菌体水平。灰色柱 显示在噬菌体接种后第3周用XF15攻击的混合物接种的葡萄树中的噬菌体水平。箭头表 示具有接种点的节段。每个柱表示由3棵葡萄树的根和2个防疫线决定的混合物中4种噬 菌体的平均CFU/gpt (克植物组织）。
[0034] 图12 :显示噬菌体Xfas303在地毯草黄单胞菌柑橘致病变种菌株上的斑点滴定结 果。
[0035] 序列表简述
[0036] SEQ ID NO :1_设计用于苛养木杆菌gyrB的苛养木杆菌-特异性寡核苷酸正向引 物。
[0037] SEQ ID NO :2_设计用于苛养木杆菌gyrB的苛养木杆菌-特异性寡核苷酸反向引 物。
[0038] SEQ ID NO :3_设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas304-特异性寡核苷 酸正向引物。
[0039] SEQ ID NO :4_设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas304-特异性寡核苷 酸反向引物。
[0040] SEQ ID NO :5_设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas303-特异性寡核苷 酸正向引物。
[0041] SEQ ID NO :6_设计用于噬菌体DNA引发酶基因的噬菌体Xfas303-特异性寡核苷 酸反向引物。
[0042] SEQ ID NO :7_设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfasl03-特异性寡核苷 酸正向引物。
[0043] SEQ ID NO :8_设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfasl03-特异性寡核苷 酸反向引物。
[0044] SEQ ID NO :9_设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfasl06-特异性寡核苷 酸正向引物。
[0045] SEQ ID NO :10-设计用于噬菌体DNA解旋酶基因的噬菌体Xfasl06-特异性寡核 苷酸反向引物。
[0046] SEQ ID NO :11_噬菌体XfaslOl的基因组序列。
[0047] SEQ ID NO :12_噬菌体Xfasl02的基因组序列。
[0048] SEQ ID NO :13_噬菌体Xfasl03的基因组序列。
[0049] SEQ ID NO :14_噬菌体Xfas 104的基因组序列。
[0050] SEQ ID NO :15-噬菌体Xfasl05的基因组序列。
[0051] SEQ ID NO :16-噬菌体Xfas 106的基因组序列。
[0052] SEQ ID NO :17_噬菌体Xfasl07的基因组序列。
[0053] SEQ ID NO :18_噬菌体XfasllO的基因组序列。
[0054] SEQ ID NO :19_噬菌体Xfas301的基因组序列。
[0055] SEQ ID NO :20_噬菌体Xfas302的基因组序列。
[0056] SEQ ID NO :21_噬菌体Xfas303的基因组序列。
[0057] SEQ ID NO :22_噬菌体Xfas304的基因组序列。
[0058] SEQ ID NO :23_噬菌体Xfas305的基因组序列。
[0059] SEQ ID NO :24_噬菌体Xfas306的基因组序列。
[0060] 发明详述
[0061] 提供下述定义和方法以更好地定义本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发 明。除非另外注释，术语应该按照相关领域普通技术