黄瓜子房的离体再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物离体再生技术领域，具体涉及黄瓜子房的离体再生方法。
【背景技术】
[0002] 黄瓜（Cucumis sativus L.)是世界上的主要蔬菜之一，栽培历史悠久，黄瓜富含 纤维素、多种维生素和矿质元素，有很高的营养及药用价值，深受广大消费者喜爱。由于种 内资源有限，很难通过常规育种方法研制出黄瓜新品种，利用基因工程技术将是今后黄瓜 品种改良的有效手段。因此建立高效的黄瓜离体再生体系，对于进一步的转基因等研究十 分必要。
[0003] 自1979年佐滕正孝获得首例黄瓜再生植株以来，黄瓜组织培养开始逐渐发展，至 今国内外对黄瓜再生培养的研究已有一些成功的报道。黄瓜再生分化的主流方法是通过子 叶、子叶节培养，以器官直接发生途径得到再生植株。在器官发生途径中，伴随有少量或没 有愈伤组织，但这些愈伤组织不分化。这种发生途径存在很多问题：①基因型制约大，部分 基因型不能通过该途径分化得到植株；②工作量大：种子灭菌-无菌苗培养-子叶/子叶节 切取-接种子叶/子叶节-诱导分化-再生苗伸长培养-再生苗生根培养，每个步骤缺一 不可；③通过该途径得到的分化苗少，单个子叶节/子叶仅能分化1-2棵完整植株，再生频 率低；④需要耗费大量的种子，如果需要1000个外植体，需要使用500-1000颗饱满、新鲜的 种子。而且受到制种周期和制种成本的制约，成本昂贵。
[0004] 通常，在黄瓜的组织培养中，影响组织培养成功率的因素主要有外植体、培养基、 激素等，高效的离体再生需要多种因素的配合。有一些利用黄瓜子叶、下胚轴、叶片、叶柄等 外植体通过愈伤组织方式再生植株的报道，但普遍存在基因型制约大、再生率低、重复性差 等问题。
[0005] 另外也有利用子房作为外植体的，如：杜胜利等（黄瓜雌核发育及染色体倍性鉴 定与加倍研究，天津：南开大学，2002)利用黄瓜未授粉子房建立离体再生体系，但该方法 得到再生植株不仅再生频率低，而且是单倍体、二倍体及多倍体的混合，需要对再生植株进 行染色体倍性鉴定来区分，大大增加了工作量。
[0006] -直以来，研究者都试图利用组织培养的方法方便而高效地得到黄瓜再生植株， 以便满足育种和品种改良的需要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种高效的黄瓜子房的离体再生方法。
[0008] 本发明提供了一种黄瓜子房的离体再生方法，它包括如下步骤：
[0009] (1)愈伤组织诱导：取黄瓜子房，灭菌后接种于愈伤组织诱导培养基中，经热激处 理后培养，获得愈伤组织；
[0010] (2)愈伤组织增殖及分化；将愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基中，培 养，获得丛生芽苗；
[0011] (3)不定苗伸长：将丛生芽苗转移到不定苗伸长培养基中，培养，使苗伸长；
[0012] (4)生根培养：将不定苗转移到生根培养基中，培养，获得离体再生植株；
[0013] 其中，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为 30 ~40g/L 的碳源、4 ~7g/L 的凝胶剂、L 2 ~2. Omg/L 的 TDZ、0. 2 ~0· 5mg/L 的 NAA ;
[0014] 所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为 30 ~40g/L 的碳源、4 ~7g/L 的凝胶齐lj、L 5 ~3. Omg/L 的 6-BA、0. 01 ~0· lmg/L 的 NAA ;
[0015] 所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30~40g/L 的碳源、5~7g/L的凝胶剂、0. 1~0. 5mg/L的6-BA ;
[0016] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30~40g/L的碳 源、7g/L的凝胶剂、0. 05mg/L的IBA。
[0017] TDZ :噻苯隆，是一种细胞分裂素；
[0018] NAA :萘乙酸，是一种生长素；
[0019] 6-BA :6_苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素；
[0020] IBA :吲噪乙酸，是一种生长素；
[0021] ΑΒΑ:脱落酸；
[0022] NB 培养基组分：KN032830mg/L、（NH4) 2S04463mg/L、CaCl2125. 33mg/L、KH2P04400mg/ L、MgS0490 . 37mg/L、H3B033mg/L、MnSO4 · H2O 10mg/L、ZnSO4 · 7H20 2mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg/L、CuSO4 · 5H20 0· 025mg/L、CoCl2 · 6H20 0· 025mg/L、KI 0· 75mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、Na2EDTA · 2H20 37. 26mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 VB5lmg/L、维生素 BJOmg/L、维生 M B6lmg/L ；
[0023] MS 培养基组分：KN031900mg/L、NH4N0316 50mg/L、KH2P04170mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、CaCl2332. 2mg/L、Na2EDTA · 2H20 37. 26mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg/L、MgS04180 . 7mg/L、CuSO4 · 5H20 0· 025mg/L、CoCl2 · 6H20 0· 025mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、MnSO4 · H20 16. 9mg/L、KI 0· 83mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 VB50. 5mg/L、维生素 B1O. lmg/L、维生素 B6O. 5mg/L。
[0024] NB培养基、MS培养基是植物组织培养常用的基本培养基，在实际应用中根据不同 培养阶段和不同材料来源，通常需要在基本培养基中加入植物激素，例如不同种类和含量 的生长素、细胞分裂素等，合适的植物组织培养基组成是植物组织培养成功的基础。
[0025] 进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度 为 30g/L 的碳源、7g/L 的凝胶剂、L 2 ~2. 0mg/L 的 TDZ、0. 2 ~0· 5mg/L 的 NAA ;
[0026] 所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为 30g/L 的碳源、7g/L 的凝胶剂、2. 0 ~3. 0mg/L 的 6-BA、0. 01 ~0. lmg/L 的 NAA ;
[0027] 所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳 源、7g/L的凝胶剂、0. 1~0. 5mg/L的6-BA ;
[0028] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/ L的凝胶剂、0· 05mg/L的IBA。
[0029] 更进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓 度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、I. 5mg/L的TDZ、0. 2mg/L的NAA ;
[0030] 所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为 30g/L 的碳源、7g/L 的凝胶剂、2. 5mg/L 的 6-ΒΑ、0· Olmg/L 的 NAA ;
[0031] 所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳 源、7g/L的凝胶剂、0. 5mg/L的6-BA ;
[0032] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/ L的凝胶剂、0· 05mg/L的IBA。
[0033] 其中，所述碳源为蔗糖；所述凝胶剂为琼脂。
[0034] 其中，步骤（1)中：所述黄瓜子房为黄瓜未授粉子房；
[0035] 所述灭菌采取的方法为：自来水冲洗2h，在超净工作台上用75%乙醇表面消毒 30s (秒），用10 %的NaClO (次氯酸钠）溶液灭菌lOmin，再用无菌水冲洗；
[0036] 所述接种采取的方法为：将子房纵剖为两半，果皮接触培养基；
[0037] 所述热激处理采取的方法为：温度34~36°C，黑暗下48~72h。
[0038] 优选地，所述黄瓜未授粉子房为黄瓜开花前4_8h的未授粉子房；所述热激处理采 取的方法为：温度35°C，黑暗下72h。
[0039] 进一步优选地，所述黄瓜未授粉子房为黄瓜开花前4h的未授粉子房。
[0040] 其中，步骤（1)-(4)中：所述培养的条件为：温度24~26°C，光照16h/d，光强 2000~25001x。优选地，所述温度为25°C，所述光强为25001x。
[0041] 其中，步骤（4)中，所述不定苗转移是指：当不定苗伸长至2cm高时切下转移。
[0042] 本发明以黄瓜子房为外植体，通过愈伤组织再生分化途径得到形态正常的普通二 倍体再生植株，建立了高效的黄瓜离体再生体系。
[0043] 本发明的有益效果如下：
[0044] (1)基因型制约较小：对中国黄瓜主要栽培类型华北型和华南型黄瓜均适用；
[0045] (2)可以实现黄瓜的高效离体再生：首先愈伤组织诱导率高，10粒种子可得到200 个子房，可诱导初始愈伤组织60个以上，大大节约种子使用量；其次愈伤组织增殖能力强， 在离体再生过程中再生的愈伤组织可以大量增殖，无限扩繁；而且愈伤组织分化能力强，单 个直径约3cm的愈伤组织可分化再生苗4-6苗，可达到黄瓜再生苗的持续不断的、规模化生 产；
[0046] (3)工作量小：与主流的子叶/子叶节诱导得到再生植株方法相比，减少了从种子 得到无菌苗的培养步骤。
[0047] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0048] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0049] 图1开花前4h的黄瓜未授粉子房。
[0050] 图2黄瓜未授粉子房诱导后获得的愈伤组织。
[0051] 图3黄瓜愈伤组织在愈伤组织增殖及分化培养基上培养30天，愈伤组织由黄绿色 变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点。
[0052] 图4黄瓜愈伤组织在愈伤组织增殖及分化培养基上培养到90天左右，见到叶、芽 分化。
[0053] 图5黄瓜愈伤组织在愈伤组织增殖及分化培养基上培养得到丛生芽。
[0054] 图6黄瓜丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养。
[0055] 图7黄瓜不定苗转移到生根培养基中，培养得到离体再生植株。
[0056] 图8黄瓜'白丝条'再生植株倍性鉴定图，8a为流式细胞仪检测正常植株PI染料 直方图，8b为流式细胞仪检测再生植株PI染料直方图，8c为正常植株流式细胞仪统计数 据，8d为再生植株流式细胞仪统计数据。
[0057] 图