一种昆虫转录因子在害虫防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及昆虫转录因子Nrf2在斜纹夜蛾防治中的应用，具体涉及Nrf2影响斜 纹夜蛾抗多种杀虫剂这一功能，从而围绕Nrf2开展转基因或抑制剂研发，提尚杀虫剂的杀 虫效率，降低化学杀虫剂的使用量，达到高效和环保进行害虫防治的目的。
【背景技术】
[0002] 各类化学杀虫剂和植物次生物质皆可引起昆虫体内氧胁迫。如2007年，Giordano 等人在小鼠小脑颗粒神经元细胞中证明有机磷杀虫剂毒死蜱能够引起细胞内R0S水平的 上升，进而诱导脂质过氧化等一系列的氧化应激反应。Ahmad等在1995年证实杀虫剂二氯 萘醌在模式昆虫亚热带粘虫中也能引起氧化应激反应。拟除虫菊酯类杀虫剂除了神经毒性 外，也能够引起昆虫的氧化应激反应。
[0003] 活性氧（reactive oxygen species，R0S)是生物体在有氧代谢过程中由氧分子 直接或间接转化而来的，对生物体有害的一类含氧物，其主要包括超氧阴离子（superoxide anion，0 2 )、过氧化氢（hydrogen peroxide，H202)、单线态氧（singlet molecular oxygen, l〇2)、轻自由基（hydroxyl radical，HO*)、烷氧基（alkoxyl，RO)和烧过氧基（Peroxyl， R00O等。当机体受到外界有毒物质的危害时，R0S过度积累。过量的过氧化物和自由基 将损害DNA、蛋白质、糖类等生物大分子物质，进而引起细胞内信息传递的紊乱、细胞膜的损 伤、细胞离子通道的损伤、细胞膜脂质过氧化，最终导致细胞凋亡甚至细胞的死亡。
[0004] 然而在生物体内存在着R0S的清除系统(抗氧化酶系统和非酶活性的抗氧化小分 子)，来抵抗活性氧对生物体的伤害，从而维持机体氧化与抗氧化的动态平衡。其中抗氧化 酶系统主要包括超氧化物歧化酶（S0D，将体内的超氧化物阴离子0 2转化成H202和02 );过 氧化氢酶（CAT，主要在过氧化物酶体和线粒体中将H202分解成H 20和02);硒依赖谷胱甘肽 过氧化物酶（SeGSH-Px，将H20 2还原为H 20,阻断H202生成高度活泼的膜过氧化剂H0?，从而 防止细胞受到羟自由基的伤害)。抗氧化小分子物质如GSH、胡萝卜素、视黄醇、维生素 C、维生素E、硫氧还蛋白等也参与R0S的清除。
[0005] 转录因子NF-E2 (NF-E2_related factor2, Nrf2)在细胞抵抗氧胁迫和亲电物 质中有着重要作用。细胞在正常状态下转录因子Nrf2在细胞质中与Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1)结合形成复合物，处于非活性状态，并由Keapl介导Nrf2泛素 化降解；当细胞发生氧化应激反应或受到亲电子物质刺激时，Nrf2被激活并从Keapl-Nrf2 复合物中解离出来，然后转入细胞核内与Maf形成异质二聚体，再与靶基因启动子上抗氧 化反应元件ARE结合，进而调控Nrf2下游基因的转录和表达。其中，Nrf2的革E1基因包括 过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、醌氧化还原酶、Y _谷氨酸合成酶以及 血红素加氧酶。特别是一相解毒酶P450和二相解毒酶谷胱甘肽S-转移酶（GST)在昆虫 抗药性中发挥重要的作用，因而Nrf2在调控昆虫抗性基因中起着重要作用。但目前昆虫 中的该方面研究较少。苯巴比妥米那（phenobarbital, P450抑制剂）通过Nrf2调控了 一些果绳解毒酶的表达（Misra JR, Horner MA, Lam G, Thummel CS. Genes Dev. 2011; 25 (17) : 1796-806.);但是，并不清楚Nrf2是否参与农业害虫抗多种杀虫剂，并在其中起着 重要的作用。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述存在的问题，本发明对中国农业害虫斜纹夜蛾开展了研究，发现 Nrf2参与昆虫抗有机磷和菊酯类化学杀虫剂、及多种植物类次生物质，其机理可能是启动 了相应的解毒酶，而敲除Nrf2会增加农业害虫斜纹夜蛾对有机磷杀虫剂毒死蜱的敏感性， 虫体死亡率大大提高。
[0007] 本发明的目的在于提供昆虫Nrf2的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 昆虫类转录因子Nrf2表达抑制剂和/或活性抑制剂在制备杀虫剂中的应用。
[0009] 进一步的，上述转录因子Nrf2表达抑制剂为能够使昆虫基因沉默的物质。
[0010] 进一步的，上述转录因子Nrf2表达抑制剂为能够对昆虫基因TVr/2进行RNA干涉 的序列。
[0011] 进一步的，上述能够对昆虫基因邀行RNA干涉的序列为SEQ ID N0 :2。
[0012] 进一步的，上述昆虫为鳞翅目昆虫。
[0013] 进一步的，上述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾。
[0014] 本发明的有益效果是： 1) Nrf2是生物体中抗氧胁迫途径的其中一个重要的调控因子，它通过调控过氧化氢 酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、醌氧化还原酶、Y _谷氨酸合成酶和血红素加氧 酶等抗氧胁迫酶的表达，而在生物体抗活性氧中发挥作用。它在哺乳动物中的研究较为详 细，有毒物质通过受体AHR激发Nrf2表达上调，但是昆虫至今没有发现类似的受体蛋白，而 且昆虫类的Nrf2序列与哺乳类有差别，因此表达可能有所不同。目前，昆虫只有极少的文 章报道，主要发现在抗有机氯杀虫剂DDT昆虫中的Nrf2酶活性较高，并没有进行它的功能 研究，同时由于DDT的剧毒性和不易降解性，农业上已停止使用。所以，Nrf2在昆虫应对杀 虫剂中的真正作用并不清楚。本发明中，采用RNAi技术敲除斜纹夜蛾体内Nrf2,发现斜纹 夜蛾对有机磷杀虫剂毒死蜱的敏感性增加，死亡率增加。因此，在应用上，可以根据Nrf2的 结构筛选其抑制剂或转基因植物获得其dsRNA，作为杀虫剂的增效剂而提高杀虫剂的杀虫 效率，降低对环境不友好的化学杀虫剂的使用剂量。
[0015] 2)本发明表明，斜纹夜蛾Nrf2除了响应毒死蜱外，还响应菊酯类杀虫剂，和不同 类型植物次生物质，包括吲哚-3-甲醇，呋喃类花椒毒素和蒽酮类鱼藤酮等，并且Nrf2调控 参与解毒这些物质的解毒酶，比如Slgstel，基因被证明是斜纹夜蛾取食植物的重 要解毒酶，敲除该基因，斜纹夜蛾不能爬行取食，生长减缓；同时可响应多种杀虫剂而表达 增加，并对多种杀虫剂具有解毒作用。因此，Nrf2同样影响斜纹夜蛾应对其他杀虫剂和植 物(含植物次生物质），由于植物次生物质对昆虫的毒性偏低，虽然具有安全性，但由于杀虫 效率低而不能大规模应用。因此可根据Nrf2开发杀虫剂增效剂，提高植物源杀虫剂杀虫 率。
[0016] 3)由于人类、哺乳类和昆虫类的Nrf2序列的相似性不高，本发明所用的dsRNA在 人类基因组中没有相应的序列，因此利用该序列进行RNAi，将对人等动物无害。
【附图说明】
[0017] 图1为毒死蜱处理24 h后各组处理的斜纹夜蛾生长情况； 图2为不同杀虫剂对Nrf2表达的诱导作用，xanthotoxin为花椒毒素、DMS0作为对 照处理；indole-3-carbinol为植物次生物质吲噪-3甲醇、rotenone为植物源杀虫剂鱼 藤酮、chlorpyrifos为有机磷杀虫剂毒死蜱、deltamethrin为菊酯类杀虫剂溴氰菊酯、 acetone丙酮作为对照(溶剂）处理；内参为GAPDH; 图3为不同杀虫剂对解毒酶P450基因份表达的诱导作用，xanthotoxin为花 椒毒素、DMS0作为对照处理；indole-3-carbinol为植物次生物质吲噪-3甲醇、rotenone 为植物源杀虫剂鱼藤酮、chlorpyrifos为有机磷杀虫剂毒死蜱、deltamethrin为菊酯类杀 虫剂溴氰菊酯、acetone丙酮作为对照处理；内参为GAPDH ; 图4为不同杀虫剂对谷胱甘肽转移酶基因表达的诱导作用，xanthotoxin为 花椒毒素、DMS0作为对照处理；indole-3-carbinol为吲噪-3甲醇、rotenone为植物源杀 虫剂鱼藤酮、chlorpyrifos为有机磷杀虫剂毒死蜱、deltamethrin为菊酯类杀虫剂溴氰菊 酯、acetone丙酮作为对照处理；内参为GAPDH ; 图5为Nrf2蛋白与gstel启动子上的相应调控元件ARE的凝胶迀移实验EMSA结果， 图中探针为gstel启动子上的调控元件ARE序列，采用生物素标记以及非标记探针进行竞 争实验来证明结合的专一性； 图6为100 yM的不同类型杀虫剂对S1GSTE1酶活性的抑制作用；其中control为 1-氯-2, 4-二硝基苯，chlorpyrifos为有机磷杀虫剂毒死蜱、Malathion为马拉硫磷、 Phoxim为辛硫磷、Deltamethrin为菊酯类的溴氰菊酯、DDT为有机氯类的DDT。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019] 实施例1抑制Nrf2表达的斜纹夜蛾幼虫对杀虫剂更敏感 1)斜纹夜蛾Nrf2dsRNA的合成 根据试剂盒T7 RiboMAX?ExpressRNAiSystem(购自Promega公司）的说明书分别 合成斜纹夜蛾Nrf2和GFP的dsRNA，用于后续的RNAi实验。
[0020] 斜纹夜蛾 Nrf2 cDNA 序列为（SEQ ID N0 :1):
[0021] 2)Nrf2 RNAi后斜纹夜蛾的表型以及对毒死蜱（CPF)处理的反应 实验分为 4 组，即 GFP RNAi(对照组)、Nrf2 RNAi、GFP RNAi+CPF