海绵细胞团冷冻保存液及其保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞团，尤其是涉及海绵细胞团冷冻保存液及其保存方法。
【背景技术】
[0002]细胞团(primmorph)是指分散的海绵动物细胞重新聚集后，形成的细胞小团，这些细胞团具有全能功能，即能够增加生物量，同时能分化出海绵的各类细胞。它是重要的实验材料，主要用于研究海绵细胞的分化、信号传递、细胞识别、基因表达等。细胞团不同于普通的细胞系，它无法无限制传代，但是它可以生长成具有三维结构的海绵。
[0003]近年来，海绵细胞离体培养的研究取得了一定的进展，稳定的传代细胞系的建立仍是世界范围内的难题。以海绵混合细胞为起点在特定情况下形成了细胞团，经研究细胞团离体培养体系具有生物量增殖能力及细胞定向分化的潜力，相较其他离体培养技术有稳定、易保存、细胞活性高的优点。现细胞团已成为海绵细胞离体培养研究的核心，但海绵细胞团培养的研究还处于起步阶段，细胞团的培养技术、形成规律及维持培养是重点研究内容。
[0004]由于细胞团的制备过程较为复杂，常常需要新鲜的海绵作为初始材料，为了便于实验研究的开展，以及课题组间实验材料的便捷传递，持续稳定的细胞团供给方法显得十分重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种海绵细胞团冷冻保存液。
[0006]本发明的目的在于提供一种海绵细胞团的保存方法。
[0007]所述海绵细胞团冷冻保存液的组成如下:
[0008]基础液、二甲亚砜、牛血清白蛋白、硅酸钠、羟基脯氨酸，按质量百分比二甲亚砜为基础液的5%?10%，牛血清白蛋白为基础液的5%?10%，硅酸钠的质量浓度为10?50mg/L，羟基脯氨酸的质量浓度为0.2?5g/L。
[0009]所述基础液可采用海水，所述海水可采用天然海水或人工海水。
[0010]所述海绵细胞团的保存方法如下:
[0011]I)将细胞团用海绵细胞团冷冻保存液清洗后，转移到装有海绵细胞团冷冻保存液的管中；
[0012]在步骤I)中，所述细胞团可采用以下方法制备:
[0013](I)将海绵动物供体切成I?4cm3小块，用无菌过滤天然海水反复清洗3次，用无菌剪刀将组织块在无菌平皿中剪成颗粒状，颗粒直径为0.5?4_3;
[0014](2)将海绵小颗粒转入50mL离心试管中，用含有0.93g/L EDTA 二钠盐的无钙镁离子的人工海水(CMFSW-E)冲洗；
[0015](3)滤出较大的海绵颗粒，再加入40ml新的CMFSW-E溶液；
[0016](4)在25°C条件下，振荡20min，获得亮黄色的悬液，弃去上清液；
[0017](5)加入20ml新鲜的CMFSW-E，振荡40min，使用50 μ m无菌尼龙网过滤，保留滤液；
[0018](6)残渣中再次加入20ml CMFSW-E，振荡40min，使用50 μ m无菌尼龙网过滤，合并滤液；
[0019](7)将滤液按照500g，5min的条件进行离心，弃上清，用无钙镁海水清洗沉淀两次；
[0020](8)加入无菌天然海水进行悬浮，控制细胞密度在(1.5?2.0) X 106ind/ml ;
[0021](9)往六孔板加入6ml细胞悬液培养，每天换三分之二，温度控制在16°C以下；
[0022](10)0.5mm大小的细胞团一旦形成，用吸管吸出，在装有1mL的15mL离心管中，用无菌天然海水洗两次，离心沉淀；
[0023](11)形成的细胞团放在天然海水中培养。
[0024]所述管可采用冻存管或麦杆管等，每管的细胞团数量可控制在20个以内。
[0025]2)将装有海绵细胞团冷冻保存液的管放在12?16°C的环境中平衡I?2h后，投入液氮(_196°C )中，进行冷冻保存。
[0026]所述海绵细胞团的解冻方法如下:
[0027](I)将需要解冻的装有海绵细胞团的管投入海水中，搅动海水使管解冻，当管内的海绵细胞团冷冻保存液初步融化并有流动迹象时，取出管；
[0028](2)将步骤(I)取出的管置于10?16°C空气中升温，平衡I?2h后，取出海绵细胞团，再用10?16°C的海水清洗I?2次，然后将海绵细胞团置于16°C自然海水中培养。
[0029]本发明的突出优点在于:
[0030]1.本发明通过获取海绵细胞团、冷冻后复苏、检测细胞活性，来测试并确定海绵细胞团冷冻保存液配方，获得一套相对完整长期保存海绵细胞团的方法。
[0031]2.本发明提供了长期保存海绵细胞的方法，为世界范围内海绵生物材料交换和海绵细胞库的建立提供了基础，为海绵研究的国际难点一海绵细胞培养，研究细胞分化增殖提供借鉴。
[0032]3.本发明的细胞活性高，冻存后再复苏的海绵细胞仍能保持与未冻存的海绵细胞相当的细胞活性和生殖力。
【具体实施方式】
[0033]以下给出海绵细胞团冷冻保存液的组成:
[0034]基础液、二甲亚砜、牛血清白蛋白、硅酸钠、羟基脯氨酸，按质量百分比二甲亚砜为基础液的5%?10%，牛血清白蛋白为基础液的5%?10%，硅酸钠的质量浓度为10?50mg/L，羟基脯氨酸的质量浓度为0.2?5g/L。所述基础液可采用海水，所述海水可采用天然海水或人工海水。
[0035]以下给出所述海绵细胞团的保存方法:
[0036]I)将细胞团用海绵细胞团冷冻保存液清洗后，转移到装有海绵细胞团冷冻保存液的管中；
[0037]所述细胞团可采用以下方法制备:
[0038](I)将海绵动物供体切成I?4cm3小块，用无菌过滤天然海水反复清洗3次，用无菌剪刀将组织块在无菌平皿中剪成颗粒状，颗粒直径为0.5?4_3;
[0039](2)将海绵小颗粒转入50mL离心试管中，用含有0.93g/L EDTA 二钠盐的无钙镁离子的人工海水(CMFSW-E)冲洗。
[0040](3)滤出较大的海绵颗粒，再加入40ml新的CMFSW-E溶液。
[0041](4)在25°C条件下，振荡20min，获得亮黄色的悬液，弃去上清液。
[0042](5)加入20ml新鲜的CMFSW-E，振荡40min，使用50 μ m无菌尼龙网过滤，保留滤液；
[0043](6)残渣中再次加入20ml CMFSW-E，振荡40min，使用50 μ m无菌尼龙网过滤，合并滤液。
[0044](7)将滤液按照500g，5min的条件进行离心，弃上清，用无钙镁海水清洗沉淀两次。
[0045](8)加入无菌天然海水进行悬浮，控制细胞密度在(1.5?2.0) X 106ind/ml。
[0046](9)往六孔板加入6ml细胞悬液培养，每天换三分之二，温度控制在16°C以下。
[0047](10)0.5mm大小的细胞团一旦形成，用吸管吸出，在装有1mL的15mL离心管中，用无菌天然海水洗两次，离心沉淀。
[0048](11)形成的细胞团放在天然海水中培养。
[0049]所述管可采用冻存管或麦杆管等，每管的细胞团数量可控制在20个以内。
[0050]2)将装有海绵细胞团冷冻保存液的管放在12?16°C的环境中平衡I?2h后，投入液氮(_196°C )中，进行冷冻保存。
[0051]以下给出所述海绵细胞团的解冻方法:
[0052](I)将需要解冻的装有海绵细胞团的管投入海水中，搅动海水使管解冻，当管内的海绵细胞团冷冻保存液初步融化并有流动迹象时，取出管；
[0053](2)将步骤(I)取出的管置于10?16°C空气中升温，平衡I?2h后，取出海绵细胞团，再用10?16°C的海水清洗I?2次，然后将海绵细胞团置于16°C自然海水中培养。
【主权项】
1.海绵细胞团冷冻保存液，其特征在于其组成如下: 基础液、二甲亚砜、牛血清白蛋白、硅酸钠、羟基脯氨酸，按质量百分比二甲亚砜为基础液的5 %?10 %，牛血清白蛋白为基础液的5 %?10 %，硅酸钠的质量浓度为10?50mg/L，羟基脯氨酸的质量浓度为0.2?5g/L。2.如权利要求1所述海绵细胞团冷冻保存液，其特征在于所述基础液采用海水。3.如权利要求2所述海绵细胞团冷冻保存液，其特征在于所述海水采用天然海水或人工海水。4.海绵细胞团的保存方法，其特征在于其具体步骤如下: 1)将细胞团用海绵细胞团冷冻保存液清洗后，转移到装有海绵细胞团冷冻保存液的管中； 2)将装有海绵细胞团冷冻保存液的管放在12?16°C的环境中平衡I?2h后，投入液氮(_196°C )中，进行冷冻保存。5.如权利要求4所述海绵细胞团的保存方法，其特征在于在步骤I)中，所述细胞团采用以下方法制备: (1)将海绵动物供体切成I?4cm3小块，用无菌过滤天然海水反复清洗3次，用无菌剪刀将组织块在无菌平皿中剪成颗粒状，颗粒直径为0.5?4_3; (2)将海绵小颗粒转入50mL离心试管中，用含有0.93g/L EDTA二钠盐的无钙镁离子的人工海水(CMFSW-E)冲洗； (3)滤出较大的海绵颗粒，再加入40ml新的无钙镁离子的人工海水(CMFSW-E)溶液； (4)在25°C条件下，振荡20min，获得亮黄色的悬液，弃去上清液； (5)加入20ml新鲜的无钙镁离子的人工海水(CMFSW-E)，振荡40min，使用50μ m无菌尼龙网过滤，保留滤液； (6)残渣中再次加入20ml无钙镁离子的人工海水(CMFSW-E)，振荡40min，使用50μ m无菌尼龙网过滤，合并滤液； (7)将滤液按照500g，5min的条件进行离心，弃上清，用无钙镁海水清洗沉淀两次； (8)加入无菌天然海水进行悬浮，控制细胞密度在(1.5?2.0) X 106ind/ml ； (9)往六孔板加入6ml细胞悬液培养，每天换三分之二，温度控制在16°C以下； (10)0.5mm大小的细胞团一旦形成，用吸管吸出，在装有1mL的15mL离心管中，用无菌天然海水洗两次，离心沉淀； (11)形成的细胞团放在天然海水中培养。6.如权利要求4所述海绵细胞团的保存方法，其特征在于在步骤I)中，所述管采用冻存管或麦杆管，每管的细胞团数量控制在20个以内。7.海绵细胞团的解冻方法，其特征在于其具体步骤如下: (1)将需要解冻的装有海绵细胞团的管投入海水中，搅动海水使管解冻，当管内的海绵细胞团冷冻保存液初步融化并有流动迹象时，取出管； (2)将步骤(I)取出的管置于10?16°C空气中升温，平衡I?2h后，取出海绵细胞团，再用10?16°C的海水清洗I?2次，然后将海绵细胞团置于16°C自然海水中培养。
【专利摘要】海绵细胞团冷冻保存液及其保存方法，涉及细胞团。所述海绵细胞团冷冻保存液的组成如下：基础液、二甲亚砜、牛血清白蛋白、硅酸钠、羟基脯氨酸，按质量百分比二甲亚砜为基础液的5％～10％，牛血清白蛋白为基础液的5％～10％，硅酸钠的质量浓度为10～50mg/L，羟基脯氨酸的质量浓度为0.2～5g/L。所述海绵细胞团的保存方法如下：将细胞团用海绵细胞团冷冻保存液清洗后，转移到装有海绵细胞团冷冻保存液的管中；将装有海绵细胞团冷冻保存液的管放在12～16℃的环境中平衡1～2h后，投入液氮(-196℃)中，进行冷冻保存。细胞活性高，冻存后再复苏的海绵细胞仍能保持与未冻存的海绵细胞相当的细胞活性和生殖力。
【IPC分类】C12N5/07, A01N1/02
【公开号】CN105076115
【申请号】CN201510545810
【发明人】卢毓浩, 王德祥, 张苑, 黄丹, 夏光远, 王伟娜
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月31日