一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂其制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂其制备工艺，属于生物农药技术 领域。
【背景技术】
[0002] 蚜虫（aphid)，又称腻虫、蜜虫，是一类植食性昆虫。目前已经发现的蚜虫总共有 10个科约4400种，其中多数属于蚜科。蚜虫是地球上最具破坏性的害虫之一。其中大约有 250种是对于农林业和园艺业危害严重的害虫。蚜虫在世界范围内的分布十分广泛，但主要 集中于温带地区。蚜虫的繁殖力很强，一年能繁殖10~30个世代，世代重叠现象突出。雌 性蚜虫一生下来就能够生育，而且不需要雄性就可以繁殖（即孤雌繁殖）。
[0003] 螨类（mites)隶属于蛛形纲（Arachnida)，蜱螨亚纲（Acari)，种类繁多，全球约有 30-50万种，是动物界中仅次于昆虫纲的第二大生物类群。以植食性为主的农业螨类在世界 各地的农作物上都有发现，危害日益严重。农业害螨是不断侵占暂时性生境的种类，对短暂 的生活环境具有高度的适应性；个体小、繁殖能力强，寿命及每个世代的周期短，是典型的 R类害虫。它们破坏植物的正常生理机能，引起落叶、落蕾、落果，轻则造成减产，削弱树势， 重则整株死亡，不少螨类还能传播植物病害，是公认的最难防治的农业害虫之一。
[0004]蚜虫和螨虫在农业生产中危害非常严重且难于防治，常常造成巨大的经济损失。 在控制害蚜和害螨方面，自20世纪50年代以来，化学农药就起到不可替代的重要作用。目 前农业上防治害蚜害螨，化学杀蚜和杀螨剂仍占现行品种的绝大部分；仅有的植物源、矿物 油剂均还属于第一代、二代杀蚜和杀螨剂，杀虫效果低，且易产生药害。然而，正因为现行 使用的杀虫剂均为化学品，害蚜和害螨虽得到了不同程度的遏制，但同时也带来了诸多的 负面影响，尤其是其对非靶标生物的杀伤以及导致的环境问题引起了全世界的广泛关注， "3R"问题（残留（residue)、抗性（resistance)和害虫的再娼獗（resurgence))也日益严 重。面对这种情况，使用高效、低毒、低残留、对环境安全的生物农药，已成为农药开发研究 的新方向。
[0005]植物源杀虫剂具有取材容易，加工使用方便，能有效地防治害虫，害虫不易产生 抗药性，不杀伤天敌，使用安全的特点，对环境不会造成污染，对人、畜毒性低。此外，寻找 有效的植物源杀虫剂对于害蚜害螨的防治具有重要意义。然而，因为植物资源不够丰富，或 者活性不是很理想，很多研究未能取得进一步的成果，而且大多均未确定其中的活性化学 成分。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种杀虫效果好的防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂；
[0007]本发明的另一个目的是提供上述防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的制备方法。
[0008] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
[0009] -种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物。
[0010] 优选的，防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物的乙酸乙 酯部位萃取物、石油醚部位萃取物或水相部位萃取物中的一种或两种以上的组合。
[0011] 最佳的，防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物的乙酸乙 酯部位萃取物。经实验验证，采用红三叶提取物的乙酸乙酯部位萃取物为主要成分作为防 治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，较其它部分萃取物的效果更好。
[0012] 防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的主要活性成分为芒柄花素、染料木素和鹰嘴豆 芽素A。
[0013] 上述防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的制备工艺，所述红三叶提取物的制备方法 如下：
[0014] 采集新鲜红三叶植物地上部位，阴干粉碎后，加入乙醇水溶液，超声或加热回流提 取，提取液减压浓缩得浸膏，然后在通风避光处晾干，制得红三叶提取物，即权利要求1所 述的红三叶提取物。
[0015] 优选的，所述乙醇水溶液，加入量是干粉体积的10-50倍，乙醇水溶液浓度为 20-100wt%;超声或加热回流提取10-90分钟。
[0016] 上述以红三叶提取物的萃取物为主要成分的防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的 制备工艺，包括如下步骤：
[0017] 1)红三叶提取物的制备；
[0018] 2)红三叶不同活性部位的制备
[0019]a.红三叶石油醚部位萃取物（以下简称石油醚部位）的制备：将红三叶提取物用 水溶解，再加入石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层，下层水溶液用石油醚重复 萃取2-5次，合并石油醚层，减压浓缩，制得红三叶石油醚部位萃取物；
[0020] b.红三叶乙酸乙酯部位萃取物（以下简称乙酸乙酯部位）的制备：石油醚萃取后 的水溶液中加入乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层水溶液用乙酸 乙酯重复萃取2-5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得红三叶乙酸乙酯部位萃取物；
[0021] c.红三叶水相部位萃取物（以下简称水相部位）的制备：将乙酸乙酯萃取后剩余 水溶液，减压浓缩，制得红三叶水相部位萃取物。
[0022] 优选的，所述步骤2)的步骤a中，红三叶提取物用其2-20倍体积的蒸馏水溶解。
[0023] 优选的，所述步骤2)的步骤a中，加入红三叶提取物2-10倍体积的石油醚。
[0024] 优选的，所述步骤2)的步骤b中，石油醚萃取后的水溶液中加入水溶液2-10倍体 积的乙酸乙酯。
[0025] 本发明提供的防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，采用的植物材料为红三叶，其为 豆科多功能优良牧草，在全世界有广泛种植。其中含有的异黄酮成分，具有雌激素样作用， 对于治疗糖尿病、癌症，特别是妇女期综合症，具有明显效果。利用该植物制备的乙酸乙酯 部位在lmg/mL的浓度下，对蚜虫的触杀活性就能达到80 %以上，对螨虫的活性高达98 %， 具有很好的开发应用前景。
[0026]同时本发明也明确其主要活性成分为芒柄花素、染料木素和鹰嘴豆芽素A。经实 验验证，红三叶乙酸乙酯部位具有非常好的杀虫活性。利用柱层析色谱、重结晶等分离手 段，从乙酸乙酯部位中分离得到3种化合物。通过现代波谱技术测定，鉴定这些化合物为异 黄酮类化合物，分别为芒柄花素（formononetin，以下简称FOR)、染料木素（genistein，以 下简称GEN)和鹰嘴豆芽素A(biochaninA，以下简称BIO)。活性检测结果表明，这3个化 合物对蚜虫和螨虫具有明显的触杀活性，处理桃蚜48小时后，LC5。分别为0. 192,0. 190和 0. 244mg/mL;处理甘蓝蚜48小时后，LC5。分别为0. 180,0. 239和0. 155mg/mL;处理朱砂叶 螨 48 小时后，LC5。分别为 0. 158,0. 273 和 0. 180mg/mL。
[0027] 本发明提供的红三叶植物源农药，对害蚜和害螨有明显的触杀作用，不易产生抗 药性，且对环境友好，有益于人类健康。此外，该植物资源丰富，制备工艺简单，在保护农业 生产方面具有很好的开发应用前景。
【具体实施方式】
[0028] 首先需要指出，本发明的实施例仅仅公开几个优选的实施方式，不应该理解成对 本发明实施的限制，本发明的保护范围仍以权利要求书所公开的内容为准。
[0029] 实施例1红三叶不同活性部位的制备
[0030] 1、红三叶提取物的制备：采集新鲜的红三叶植物的地上部位，阴干，粉碎。加入20 倍体积乙醇，超声提取30分钟，重复提取3次。将提取溶剂减压浓缩，得浸膏，在通风避光 处，晚干，得红二叶提取物。
[0031] 2、红三叶不同活性部位的制备：取制得的红三叶提取物20g，用5倍体积的蒸馏水 100mL溶解，在水溶液中加入3倍于水溶液体积的石油醚300mL，剧烈振荡，静置分层，上清 液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，减压浓缩，制得红三叶石油醚部位。将石油醚 萃取后剩余水溶液中加入3倍体积的乙酸乙酯300mL，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸 乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得红三叶乙酸乙酯部位。将萃取后剩 余水溶液，减压浓缩，制得红三叶水相部位。
[0032] 实施例2不同活性部位对桃蚜的杀虫活性
[0033] 参照已报道权威经典测试方法一点滴法（ZhaoQ.Q.，LiY.Q.，XiongL.X.，et al.J.Agric.FoodChem. 2010, 58, 4992-4998.) 〇
[0034] 杀虫剂称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯和水相不同活性部位物质l_2mg，分别加 入含10%蒸馏水的丙酮液配制成1. 〇〇mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液依次稀释成 0. 50、0. 25、0. 10和0. 05mg/mL的溶液，加入药液体积1%的表面活性剂JFC(C7~C9烷醇 聚氧乙烯醚），混合均匀即得杀虫剂。配置药液浓度分别为。然后用微量点滴器将药液点滴 在桃蚜腹部背部，点滴完毕后，各处理分别放入培养皿中（每个培养皿中30只），24h后检 查死亡数。以含10%蒸馏水的丙酮液稀释同样的倍数+表面活性剂JFC点滴处理作为溶剂 对照。计算死亡率和校正死亡率。平行重复3次。不同组分杀虫剂对桃蚜的触杀效果见表 1〇
[0035] 从表1，我们可知红三叶乙酸乙酯的活性高于石油醚部位和水相部位。其中，在 lmg/mL浓度下，处理24h后，石油醚部位和乙酸乙酯部位对桃蚜的触杀活性在50%以上；处 理48h后，乙酸乙酯部位对桃蚜的触杀活性达到80%，石油醚部位和水相的活性为60%左 右。从表2可知，虽然乙酸乙酯部位最强，但是石油醚和水相也具有明显的活性，这些将为 在进一步开发和应用红三叶杀虫剂过程中精简工艺路线提供可能，有利于降低生产和使用 成本，且更为安全环保。
[0036] 表1红三叶不同活性部位对桃蚜的触杀活性
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[0038] 表2红三叶不同活性部位对桃蚜的LC5。值
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[0040]实施例3不同活性部位对甘蓝蚜的杀虫活性
[0041] 活性测试方法与对桃蚜活性方法相同。红三叶不同部位对甘蓝蚜的活性测试结果 见表3。其中，在lmg/mL浓度下，处理24h后，乙酸乙酯部位对甘蓝蚜的触杀活性就在60 % 以上；处理48h后，乙酸乙酯部位对甘蓝蚜的触杀活性达到80%以上，石油醚部位和水相的 活性均大于60%。从表4,我们可知红三叶乙酸乙酯的活性高于石油醚部位和水相部位。