一种自由生活海洋线虫液体培养液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋后生动物培养技术领域，具体涉及一种自由生活海洋线虫液体培 养液及其应用。
【背景技术】
[0002] 自由生活海洋线虫（Free-livingmarinenematodes)绝大多数种类属于线虫动 物门（Nematoda)泄腺纲（Adenophorea)，是小型底栖动物永久性成员，也是海洋中最丰富 的后生动物类群，可占后生动物数量的60~90%以上，丰度最高可达每平方米数百万个个 体。
[0003] 自由生活海洋线虫的分布广泛，甚至在极端环境中也有它们的存在，同时由于它 们食性多样，占据不同的营养级位，是底栖食物网中不可缺少的一环。尤其是食细菌线虫， 是海洋线虫中的优势营养类群，它们直接捕食细菌，与底栖生态系统功能与过程的联系最 密切，能够促进有机物质的分解、养分的矿化及植物的生长，在摄食和刺激微生物的生产方 面具有全球性效应，在海洋底栖生态系统的能量流动和物质循环中发挥着重要的作用。
[0004] 虽然自由生活海洋线虫的身体微小，大部分生境中其生物量不到大型底栖动物的 20%，但由于其生活周期短，生长繁殖速度快，结构简单，野外取样方便等，使其成为优良的 科研实验材料。人们熟知的土壤自由生活的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans)，其 作为基因、分子与发育生物学研究模式生物的成功引发了众多科学家对与秀丽隐杆线虫亲 缘关系相近的海洋自由生活线虫的兴趣，因此进行自由生活海洋线虫的培养成为很多实验 室的迫切需求，特别是在极端条件下（如高温、低温、无氧）生活的海洋线虫是研究转基因 和细胞程序性死亡的优良分子生物学模型。由于自由生活海洋线虫直接与周围环境接触， 表皮具有渗透性，对环境的变化更敏感，作为海洋环境质量监测的指示生物也引起人们的 广泛关注。
[0005] 此外，在底栖生态系统中，自由生活海洋线虫通常是许多经济鱼、虾、蟹、贝类早期 幼龄阶段的优质天然饵料。因为其生活周期短、繁殖力高，通过人工培养可以获得高生产 量，有潜力成为物美价廉的生物饵料来源。
[0006] 以上自由生活海洋线虫在科研与生产中的应用都离不开人工培养获得活体材料， 但是目前培养技术十分有限，迫切需要发展可操作性强、快速高效的培养方法。
[0007] 目前已有的海洋线虫培养方法主要采用琼脂平板培养，具体方法是利用琼脂粉、 谷物粉、海水制作平板培养基，利用皮氏培养皿（通常皿底直径为60~120mm，皿高为15~ 25mm)作为培养容器。其中琼脂的质量百分数为0. 12~0. 80% ;谷物粉的质量百分数为 0. 12~0. 80%，可以使用玉米粉、燕麦粉、混合谷物粉等；海水可以使用人工海水或自然海 水，盐度根据所培养的线虫种类确定。以上现有海洋线虫培养方法存在以下不足：培养规 模有限，要获得较大数量的活体材料所需时间较长。因培养基的琼脂含量不同也存在不同 方面的缺陷，如果琼脂质量百分数为0. 12~0. 30 %，虽然不容易受到微生物污染，但是培 养基老化较快，通过实验发现25°C条件下10~14天必须转移接种一次，20°C条件下21~ 28天必须转移接种一次，频繁的转移接种，增加了人力和物力成本；如果琼脂质量百分数 为0. 31~0. 80%，虽然培养基老化较慢，但是很容易受到微生物污染，对线虫的培养不利。
【发明内容】
[0008] 本发明提出了一种自由生活海洋线虫液体培养液及其应用，提供的培养液配方简 单，配制方便，可以满足海洋线虫所需营养，短期内可以获得大量的活体材料，从而弥补现 有技术的不足。
[0009] 本发明首先提供一种培养液，是溶解有全脂奶粉的灭菌海水，
[0010] 作为实施例的优选，全脂奶粉在培养液中的质量百分比浓度为0. 10~0. 20%，
[0011] 其中灭菌海水，其盐度优选为与自由生活海洋线虫原生境海水盐度相同。
[0012] 本发明培养液的一种具体制备方法如下：
[0013] 将海水过滤后加热煮沸消毒，称取全脂奶粉，待海水温度降至40~60°C时，加入 全脂奶粉至海水中，摇匀，使全脂奶粉均匀溶解于海水中，得到新鲜培养液，自然冷却到室 温完成制备。
[0014] 本发明的培养液用于培养自由生活海洋线虫；
[0015] 本发明还提供一种培养自由生活海洋线虫的方法，其步骤如下：
[0016] 使用消毒的移液器或刻度吸管吸取lmL处于对数生长期的自由生活海洋线虫接 种液，其密度大于50条/mL，加入到盛有培养液的具塞玻璃容器中，放置在22~28°C恒温 避光条件下进行培养；待培养液中海洋线虫的密度达到500条/mL或以上时，进行接种扩大 培养。
[0017] 本发明的培养液还用于自由生活海洋线虫的保种。
[0018] 本发明采用液体培养，培养液组分简单，配制方便，其中的全脂奶粉富含蛋白质、 脂类、碳水化合物、钙、磷、铁及维生素等多种营养物质，满足了海洋线虫的营养需求。本方 法接种操作简单方便，通过扩大培养，短时间内能够获得大量的海洋线虫活体材料，后续的 分离收集方便。通过本发明的实施，在实验室条件下数种自由生活海洋线虫已经成功传代 保种2年以上，通过扩大培养持续获得已知年龄与生理状态的大量活体材料，可用于遗传 学、分子生物学、发育生物学以及生态毒理学的研究。
【附图说明】
[0019] 图1 :25°C条件下自由生活海洋线虫Diplolaimellasp.的密度变化曲线图，
[0020] 图2 :10°C条件下自由生活海洋线虫Diplolaimellasp.的密度变化曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明所使用的全脂奶粉是指由纯乳生产的，蛋白质含量不低于24%，脂肪含量 不低于26 %，乳糖含量不低于37 %，并富含钙、磷、铁以及各种维生素等。
[0022] 下面结合实施例对本发明的培养方法进行详细的描述
[0023] 1?线虫Diplolaimellasp.培养液的配制
[0024] 将100g盐度为20%。过滤海水放入250mL的消毒三角烧瓶中，加热煮沸消毒。称取 〇.l〇g超市购买的雀巢牌全脂奶粉，待海水温度降至40~60°C时，加入至海水中，摇匀，使 全脂奶粉均匀溶解于海水中，得到新鲜培养液，自然冷却至室温备用。
[0025] 2?线虫Diplolaimellasp?的接种与扩大培养
[0026] 使用消毒后的刻度吸管吸取lmL处于对数生长期的线虫Diplolaimellasp.接种 液，平均密度为（60±5)条/mL，加入到盛有100g新鲜培养液的三角烧瓶中，塞好棉塞，放置 在25°C恒温避光条件下进行培养。25°C恒温避光条件下线虫Diplolaimellasp.种群密度 随时间变化的曲线见图1。
[0027] 第20天时，线虫Diplolaimellasp.的种群平均密度达到（537. 8± 15. 2)条，即 100mL培养液中线虫Diplolaimellasp.平均数量达到（53780± 1520)条。
[0028] 同时与现有海洋线虫培养技术一一琼脂平板培养法进行了对比试验，试验结果见 表1(注：由于琼脂平板培养法无法在培养过程中进行线虫密度的测定，所以只给出在实验 结束时收集得到的线虫数量）。
[0029] 表1本发明方法与琼脂平板培养法比较
[0030]
[0032] 利用该培养液进行扩大培养，接种比例随培养体积的增大需要适当提高，例如 1000g培养液接种线虫Diplolaimellasp.数量要在1000条以上，即吸取2mL原培养液 加入至l〇〇〇g新鲜培养液中，以保证较短时间内可以获得较大数量的线虫Diplolaimella sp.活体。剩余原培养液中的线虫可以通过过滤进行收获。
[0033] 3?线虫Diplolaimellasp?的保种条件
[0034] 使用消毒后的刻度吸管吸取lmL处于对数生长期的线虫Diplolaimellasp.接种 液，平均密度为（220±16)条/mL，加入到盛有100g新鲜培养液的三角烧瓶中，塞好棉塞，放 置在10°C恒温避光条件下进行保种。10°C条件下线虫Diplolaimellasp.的种群密度变化 曲线见图2。由图2可以看出线虫Diplolaimellasp.的种群增长缓慢，在此情况下无需频 繁接种转移，每20天抽取lmL培养液镜检保种情况，如无污染等问题出现，每60天转移接 种一次。保种状态的线虫Diplolaimellasp.重新放置在25°C恒温条件下进行避光培养， 经过一段时间的适应，活力得到恢复。
【主权项】
1. 一种培养液，其特征在于，所述的培养液是溶解有全脂奶粉的灭菌海水。2. 如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的全脂奶粉在培养液中的质量百分 比浓度为〇? 10~0.20%。3. 权利要求1所述的培养液的制备方法，其特征在于，所述的制备方法是将海水过滤 后加热煮沸消毒，称取全脂奶粉，待海水温度降至40~60°C时，加入全脂奶粉至海水中，摇 匀，使全脂奶粉均匀溶解于海水中，自然冷却到室温完成制备。4. 权利要求1所述的培养液在培养自由生活海洋线虫中的应用。5. -种培养自由生活海洋线虫的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下： 使用消毒的移液器或刻度吸管吸取ImL处于对数生长期的自由生活海洋线虫接种液， 其密度大于50条/mL，加入到盛有权利要求1所述的培养液的具塞玻璃容器中，放置在 22~28°C恒温避光条件下进行培养；待培养液中海洋线虫的密度达到500条/mL或以上 时，进行接种扩大培养。6. 权利要求1所述的培养液用于自由生活海洋线虫的保种。
【专利摘要】本发明提出了一种自由生活海洋线虫液体培养液，是溶解有全脂奶粉的灭菌海水。本发明采用液体培养，培养液组分简单，配制方便，其中的全脂奶粉富含蛋白质、脂类、碳水化合物、钙、磷、铁及维生素等多种营养物质，满足了海洋线虫的营养需求。本方法接种操作简单方便，通过扩大培养，短时间内能够获得大量的海洋线虫活体材料，后续的分离收集方便。通过本发明的实施，在实验室条件下数种自由生活海洋线虫已经成功传代保种2年以上，通过扩大培养持续获得已知年龄与生理状态的大量活体材料，可用于遗传学、分子生物学、发育生物学以及生态毒理学的研究。
【IPC分类】A23K1/00, A01K67/033, A23K1/18
【公开号】CN105104308
【申请号】CN201510431820
【发明人】张艳, 李朝霞, 王鑫, 王文琪
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月22日