开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌剂及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是一种开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌剂。
【背景技术】
[0002] 马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖是马铃薯原原种生产的基础环节，在相对短的时间 内保证和提高试管苗快繁的质量对马铃薯种薯生产具有重要意义。然而，马铃薯脱毒试管 苗快繁过程中经常由于各种原因出现不同菌类的污染，如细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等，这 些微生物生长速度快。细菌、酵母菌、放线菌污染经过2~3次转接后可以去掉污染。而霉 菌污染可直接侵入到试管苗组织内部，用一般的消毒方法很难处理，孢子的扩散会造成大 面积的污染，扩展速度很快，且扩散后继代苗仍全部表现为污染。霉菌污染后的试管苗生长 缓慢，长势弱，生根少或不生根，污染苗移栽成活率低，严重影响试管苗的生长，给生产带来 损失。为了解决马铃薯快繁过程中污染的问题，针对马铃薯脱毒试管苗快繁中控制污染发 生的研究工作，已有了一些报道。
[0003] 陈亚兰（2012)以不同浓度的医用抗生素、防腐剂、化学农药为抑菌剂，培养基经高 温灭菌后直接用注射器注入抑菌物质，研究马铃薯组培苗扩繁中的抑菌效果以及对组培苗 生长及生根的影响。试验结果表明，70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和50%多菌灵可湿性粉剂 对马铃薯组培苗生产中最常见的青霉菌、细菌和酵母菌3种菌都具有较好抑制作用，并且 对马铃薯试管苗的生长以及生根产生的负影响最小。
[0004] 彭广霖等（2012)在MS培养基中分别加入5、10、20、30和40 mg / L次氯酸钠，以 马铃薯组培苗为试验材料，分析对组培苗枯草杆菌(细菌)污染的防治效果。结果表明，经过 2~3次转接后，5和10 mg / L次氯酸钠对马铃薯组培苗枯草杆菌的抑菌效果较好，该浓 度处理组的组培苗未出现污染，且苗木生长较好，但随着浓度的升高防治效果明显下降。
[0005] 宿飞飞等（2012)采用平板生长抑制法，用苦参、中草药和黑农一号3种植物源杀 菌剂，对植物组织培养中青霉菌抑菌效果进行研究。分别配制成不同浓度梯度的药液，对照 为不加植物源杀菌剂的培养基，经高温高压灭菌后，准确量取一定量的药液加入到热的培 养基中。结果表明，在培养基中加入黑农一号抑菌剂抑制青霉菌的效果最好，浓度在2. 0% 时，抑菌率达100. 0%。
[0006] 宿飞飞等（2010)在培养基中加入卡那霉素、青霉素、链霉素及青霉素和链霉素配 合使用的抗生素，研究抑菌剂在马铃薯快繁过程中的抑制细菌的效果。结果表明：在培养基 中加入卡那霉素、青霉素 G钠、青霉素和链霉素的混合物都能抑制细菌的污染，但青霉素各 处理不仅能抑制细菌污染，而且对试管苗的生长有明显的促进作用，其中青霉素60 mg · L- 的效果最好，同时抑菌剂的抑菌作用具有时效性。
[0007] 王春（2004)在马铃薯组织培养中试验了 4种抗生素的抑菌效果。结果表明，培养 基添加20mg / L氨苄西林钠或硫酸链霉素时，能有效抑制品种大西洋试管苗的细菌性 浸染。
[0008] 杨晨（2012)试验观察了不同浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾在马铃薯脱毒试管苗快 繁中的抑菌效果。结果表明，在MS培养基中加入山梨酸钾有明显的抑菌效果，且对试管苗 的生长有明显的促进作用，其中以20 mg / L的用量效果最好。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是：提供一种开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌剂及其使用方 法，它能降低马铃薯试管苗中霉菌的污染，降低污染率和生产成本。
[0010] 本发明解决技术问题采用如下技术方案：开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌 剂，以次氯酸钠作为唯一成分。
[0011] 开放式培养马铃薯组培苗的霉菌抑菌剂的使用方法，将次氯酸钠加入开放式培养 马铃薯组培苗的培养基中，使其占培养基总质量的0. 5%。
[0012] 在进行开放式培养前，先采用次氯酸钠溶液对开放式培养的器具进行清洗，再用 冷开水洗涤器具，再按流程进行开放式培养。
[0013] 为了验证本发明的技术效果，发明人进行了如下实验： 1试验材料 1. 1霉困 试验用的霉菌菌种是从污染的组培苗中分离获得。
[0014] 1.2抑菌类试剂 大蒜素：Solarbio, Ig进口分装，培养基烧开融化或灭菌稍冷时加入，由于价高，仅用 于试验2。
[0015] 新鲜大蒜：市场购买。称取50g新鲜大蒜，水果搅拌机打碎，用50ml无菌水溶 解，3层纱布过滤，再用进口的无菌过滤器过滤。大蒜素在高温下易被破坏，而失去杀菌作 用，因此培养基烧开融化或灭菌稍冷时加入，用于试验3。按大蒜约含1%的大蒜素计算 (资料来源：网讯），50g大蒜中含有0.5g (即500mg)大蒜素。通过过滤获得的溶液体积为 64ml, Iml的新鲜大蒜液中含有大蒜素7. 8mg,试验3的新鲜大蒜液用量为5ml,即含大蒜素 大约 40mg/L。
[0016] 次氯酸钠：天津富宇精细化工有限公司生产，有效氯成分为彡10%，500ml装。
[0017] 植培灵：上海宇涵生物科技有限公司生产，产品批号为141218, 100ml。
[0018] 益培隆：上海宇涵生物科技有限公司，产品批号141015, 10g。
[0019] 多菌灵 a :Aladdin, C9H9N3O2, Mff=191. 19,分析纯（％) lg，价高，仅用于试验 1。
[0020] 多菌灵b :加拿大凯姆科尔生化科学(集团)有限公司生产，进口 400g装，80%WP，用 于试验2和试验3。
[0021] 1.3培养基 菌类和马铃薯试管苗生长培养基均为购买的MS培养基(恒因公司购买)。
[0022] 1.4马铃薯组培苗 本试验采用"费乌瑞它"突变选育5-6代稳定的株系37A、以及在西藏引进的红皮黄肉 的马铃薯"西红"组培苗为试验材料，以未加抑菌剂的原株系为对照。
[0023] 试验方法与结果 2. 1试验1 2. I. 1试验日期与地点：2015年2月10日，贵州省生物技术研究所实验室。
[0024] 2. I. 2试验处理设置 1) 次氯酸钠（C):浓度梯度为0. 0%(CK)，0. 005%，0. 01%，0. 02%，0. 03%;每瓶接种马铃薯 组培苗8株，每个处理5瓶（以下处理均同）； 2) 多菌灵 a(DJ) :0%(CK)，15mg/L, 30mg/L, 45mg/L, 60mg/L, 75mg/L; 3) 益培隆（Y) : 0. 0% (CK)，0. 3% (厂家推荐浓度）； 4) 植培灵（Z) :0·0%(□()，2.5ml/L (厂家推荐浓度)。
[0025] 2. 1. 3培养基处理及数据统计：全部培养基用灭菌锅灭菌处理。随机抽取3瓶20 株观察株高和生根情况。
[0026] 2. 1. 4试验结果 1)C 处理的株高（5.99cm)明显高于对照（5. 19 cm)、DJ (3.87cm)、Y(3. 58cm)、 Z(3. 65cm)处理。DJ处理的植株高度（3. 87cm)与对照（2. 51cm)相比略高于对照(表1)。
[0027] 2) C处理随处理浓度加大植株高度逐渐增加；DJ处理的植株高度在45mg/L浓度 范围内随浓度的加大而增加，超过这个浓度，株高随浓度加大而降低(表1 )。
[0028] 3)据观察，与CK相比，DJ、Y、Z 3个处理的根明显生长不良，95%以上植株的根为 0-2条，而且较短（0. 3-0. 5cm)。而C处理的根为3-8条，长度为3-5cm，与CK相近。
[0029] 2. L 5第1次试验结果总结 1) 试验采用的浓度对处理间植株高度的影响差异不明显； 2) DJ、Y、Z 3个处理的根生长受抑制； 3) 全部试验没有污染。
[0030] 根据第1次试验结果，调整试验设计，加大处理间的浓度梯度，在开放条件下接种 霉囷试验。
[0031] 试验 2 2. 2. 1试验日期与地点：2015年2月11日，贵州省生物技术研究所实验室。
[0032] 2. 2. 2试验设置 1)次氯酸钠（C):浓度处理为 0· 0% (CK)，0· 01% (C1)，0· 05% (C2)，0· 1% (C3)，0· 5% (C4)， I. 0%(C5);每个处理灭菌接种组培苗5瓶，每瓶15株；开放性接种霉菌，每个浓度接种培养 皿3个，每个接种霉菌菌块1块（2-3mm，见图1 )，对照是不加抑菌剂并在相同条件下开放相 同时间的处理； 2) 多菌灵b (DJ):浓度处理为O mg/L (CK)JOmgA(DJ1), 40mg/L(DJ2)，60mg/L(DJ3), 80mg/L (DJ4)，100mg/L (DJ5)，每瓶10株，每个处理灭菌接种组培苗5瓶，每瓶15株；开放性 接种霉菌，每个浓度接种培养皿3个，每个接种霉菌菌块1块（2-3mm，见图1)，对照是不加 抑菌剂并在相同条件下开放相同时间的处理； 3) 益培隆（Y):浓度处理为 0· 0% (CK)，0· 1% (Y1)，0· 2% (Y2)，0· 3% (Y3，厂家推荐浓 度)，0. 4% (Y4)，0. 5% (Y5);每瓶10株，每个处理灭菌接种组培苗5瓶，每瓶15株；开放性接 种霉菌，每个浓度接种培养皿3个，每个接种霉菌菌块1块（2-3mm，见图1)，对照是不加抑 菌剂并在相同条件下开放相同时间的处理； 4) 植培灵（Z):浓度处理为 O.Oml/L (CK)，LSmVL(Z1)，2. OmVL(Z2)，2. 5ml/L (厂家推荐浓度）（Z3)，3. 0ml/L(Z4)，3. 5ml/L (Z5)，每个处理灭菌接种组培苗5瓶，每瓶15 株；开放性接种霉菌，每个浓度接种培养皿3个，每个接种霉菌菌块1块（2-3mm，见图1)，对 照是不加抑菌剂并在相同条件下开放相同时间的处理； 5 )大蒜素（DS):浓度处理为 0% (CK)，lmg/L (DS1)，2mg/L (DS2)，3mg/L (DS3)，4mg/ L (DS4)，5mg/L (DS5)，每个处理灭菌接种组培苗5瓶，每瓶15株；开放性接种霉菌，每个浓 度接种培养皿3个，每个接种霉菌菌块1块（2-3mm，见图1)，对照是不加抑菌剂并在相同条 件下开放相同时间的处理； 2. 2. 3培养基及数据统计 1)接种组培苗处理的培养基全部灭菌锅灭菌，接种霉菌的培养皿仅将培养基烧开，在 开放条件下(实验室