一种枯草芽孢杆菌发酵液的应用和含有该枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉微生物技术，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵液的应用和含有该枯草芽 孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 微生物是生物杀菌剂的重要来源，从中发现并商品化的品种多达几十种。相比 化学杀菌剂，微生物杀菌剂具备选择性高、安全性好、易降解、用量少、残留少、污染小等 优点。据统计，目前国际上生物农药产品已超过100多种，但90%以上是微生物杀虫剂。 Philip (2002)预测第二个重要的商业化的生物农药将是微生物杀菌剂。微生物杀菌剂主要 有农用抗生素、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂等类型。由于细菌的种类多、数量大、繁殖速度快， 可以通过功能基因的修饰、改造、转移等基因工程手段构建新型的工程菌，且易于人工培养 和控制。因此，细菌杀菌剂的研究和开发具有较大的前景。
[0003] 近年来，以细菌防治植物病害取得了较大的进展。在国外用放射土壤杆菌k84菌 系防治果树的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美国报道，用草生欧氏杆菌防治梨火 疫病效果与链霉素相当。在我国细菌生物防治剂的研究方面也取得了一定的成果。开发成 功的细菌杀菌剂有亚宝（枯草芽孢杆菌）、力宝（假单胞菌）、增产菌（蜡质芽孢杆菌），地 衣芽孢杆菌制剂和荧光假单胞制剂也已商品化。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗 木霉（绿色木霉TR-8)和拮抗细菌（芽孢杆菌B67)混合发酵制成健根宝粉剂，成功用于防 治蔬菜和甜瓜的苗期病害。其他报道的细菌杀菌剂还有：用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的 地衣芽孢杆菌，防治甘蓝黑腐病的枯草芽孢杆菌，以及防治水稻纹枯病的假单孢菌等。
[0004] 细菌作为一种重要的微生物资源，其抑菌活性值得深入研究。用于生 防的细菌以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌（B. subtilis)、解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens)、多粘芽抱杆菌（B. polymyxa)、錯状芽抱杆菌（B. cereus)、地衣芽 抱杆菌（B. Iicheniformis)、巨大芽抱杆菌（B.megaterium)和短小芽抱杆菌（B.pumilis) 等。它们大量存在植物根际，定殖于植物根面，繁殖快，可产生嗜铁索和抗生素，在植物局部 和空间微环境与目的菌竞争，对多种植物病原菌有抑制作用。由于芽孢杆菌具有抑制植物 病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关 注。
[0005] 国内外学者先后分别报道了具有生物控制作用的各个不同株系的枯草芽孢杆菌 的生物学特征、定殖条件、抗菌物质理化特性等相关研究及其在不同作物根部定殖情况、对 腐霉、镰刀菌等引起的不同土传病害的防治效果、潜在的诱导植物产生抗病性及促进幼苗 生长等方面的研究。已有研究表明，因芽孢杆菌能生产内生芽孢，具有极强的抗逆能力，相 比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工及在环境中存活，定殖与繁殖。
【发明内容】
[0006] 为了使枯草芽孢杆菌在杀菌中的应用，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌发酵液的 应用和含有该枯草芽孢杆菌的微生物杀菌剂及其制备方法。
[0007] 本发明的技术方案是：一种微生物杀菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012 发酵液。
[0008] 本发明的进一步改进包括：
[0009] 所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012,保藏在中国 典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2015206,保藏单位地址是：中国湖北 省武汉市武汉大学，保藏时间为2015年4月7日。
[0010] 本发明的另一目的在于提供如上述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012 发酵液在制备抑制小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌或灰霉病菌药物中的应用。
[0011] 所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012的培养基为ro培养基，其中含 有马铃薯200g水煎液，葡萄糖12g，加水配制1000ml，并调节pH值6. 5-7. 5。
[0012] 所述的一种微生物杀菌剂，主要组成为：按体积比分别为枯草芽孢杆菌的发酵液 75. 9 %、硅藻土 10 %、分散剂PVA 7. 2 %、润湿剂D425 4. 8 %、稳定剂CMC-Na 2. 0 %、保护剂 FWA 0· 1 % 〇
[0013] 本发明还提供了一种制备上述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：发酵液 7-8质量份与填料1-1. 2混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉；在母粉里添加分散剂 0. 5-0. 7 份、润湿剂 0. 4-0. 5 份、稳定剂 CMC-Na 0. 15-0. 3 份、保护剂 FWA 0. 01-0. 02 份，以 上添加物混合均匀后经气流粉碎机粉碎即可制得发酵液制剂。
[0014] 如上述一种微生物杀菌剂的使用方法，兑水使用，微生物杀菌剂：水按质量比例为 1 : 1000,此时菌剂溶液中活芽孢数为lX106cfu/g。
[0015] 本发明进一步提供了一种微生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1)菌种活 化，将保存在4°C冰箱里的MHA的试管斜面上的菌种取出，在室温下放置IOmin ;然后用接 种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，36-38Γ下进行活化培养24h，备用；（2) 种子液的制备，将平板上培养的活化菌株接入到装有100ml 培养基的250ml三角瓶中， 37± 1°C，130r. min \振荡培养24h ; (3)发酵培养，将上述培养好的种子液，按1 %的体积比 例接种至F1D培养基中，28°C，振荡培养36h，（4)分尚菌体与发酵液，将发酵培养好的培养 物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发酵液；（5)发酵液7-8份与填料 1-1. 2混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉。
[0016] 本发明提供的微生物杀菌剂对小麦赤霉病菌（Gibberella zeae)、水稻纹枯病菌 (Thanatephorus cucumeris)和灰霉病菌（Botrytis cinerea)等病原真菌有很好的抑制效 果。
【附图说明】
[0017] 图1枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012的显微照片。
[0018] 图2枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012系统发育树的构建。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图对本发明做详细说明。
[0020] 所述的微生物杀菌剂可按如下方法获得：在ro培养基中发酵枯草芽孢杆菌，将得 到的发酵液与活体菌分离。
[0021] 所述的ro培养基中含有马铃薯200g，葡萄糖12g，加水1000ml，PH值约为7. 0左 右。
[0022] 该活体菌制剂是经过下述方法制成的：
[0023] (1)菌种活化
[0024] 将保存在4°C冰箱里的（MHA的试管斜面上的）菌种取出，在室温下放置lOmin。然 后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，37土 1°C下进行活化培养24h，备 用。
[0025] (2)种子液的制备
[0026] 将平板上培养的活化菌株接入到装有100mL 培养基的250ml三角瓶中， 37±l°C，130r.min \ 振荡培养 24h。
[0027] (3)发酵培养
[0028] 将上述培养好的种子液，按1 %的体积比例接种至]3D培养基中，28 °C，振荡培养 36h〇
[0029] (4)分离菌体与发酵液
[0030] 将发酵培养好的培养物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发 酵液。
[0031] (5)活菌体制剂
[0032] 将上述湿菌体与3倍重量的CaC03 :沸石粉=I : 1混合并搅拌均匀，之后在50°C 真空干燥箱中干燥30min。将干燥好的物质研磨成千粉即得活体菌制剂。
[0033] 该发酵液制剂的制作方法：
[0034] 发酵液7-8份与填料1-1. 2混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉。在母 粉里添加分散剂〇. 5-0. 7份、润湿剂0. 4-0. 5份、稳定剂CMC-Na 0. 15-0. 3份、保护剂FWA 0. 01-0. 02份，以上添加物混合均匀后经气流粉碎机粉碎即可制得发酵液制剂。
[0035] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0036] 一、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)HU2012干粉菌剂的制备
[0037] (1)菌种活化
[0038] 将保存在4°C冰箱里的（MHA的试管斜面上的）菌种取出，在室温下放置lOmin。然 后用接种环以平板划线法接入预先制作好的MHA平板上，37土 1°C下进行活化培养24h，备 用。
[0039] (2)种子液的制备
[0040] 将平板上培养的活化菌株接入到装有100mL 培养基的250ml三角瓶中， 37±l°C，130r.min \ 振荡培养 24h。
[0041] (3)发酵培养
[0042] 将上述培养好的种子液，按1 %的体积比例接种至]3D培养基中，28 °C，振荡培养 36h〇
[0043] (4)分离菌体与发酵液
[0044] 将发酵培养好的培养物，在转速8000rpm下离心10min，然后分别收集湿菌体和发 酵液。
[0045] (5)活菌体制剂
[0046] 将上述湿菌体与3倍重量的CaCO3 :沸石粉=I : 1混合并搅拌均匀，之后在50°C 真空干燥箱中干燥30min。将干燥好的物质研磨成千粉即得活体菌制剂。
[0047] 二、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)HU2012发酵液制剂的制备
[0048] 发酵液7-8份与填料1-1. 2混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉。在母 粉里添加分散剂〇. 5-0. 7份、润湿剂0. 4-0. 5份、稳定剂CMC-Na 0. 15-0. 3