一种全抗家蚕血液型脓病的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种育种方法，尤其涉及一种全抗家蚕血液型脓病的育种方法，属于动物育种技术领域。
【背景技术】
[0002]家蚕(Bombyx mori L.)属鳞翅目、蚕蛾科。家蚕起源于我国，早在四、五千年前，我们祖先就栽桑养蚕，是举世公认的伟大发明之一。我国四川、浙江、江苏、广东的养蚕业最为发达，因病毒性疾病所造成的损失，约占总蚕病损失的70-80%，而家蚕核型多角体病毒(NPV)病是养蚕生产上最常见的危害最严重的一类蚕病，家蚕患此病的后期常流出脓汁，内含大量的多角体病毒，俗称脓病。家蚕核型多角体病毒(Bombyx moriNucleopolyhedrovirus, BmNPV)，多角体的形状不一，多数为四角形、六角形，多角体的大小范围在0.5-15 μ之间，一般为2-6μπι。病毒粒子为杆状，测定其大小为400X90nm。在病毒粒子的超微结构中，最显著的是在粒子一端具有乳头状突起，认为是病毒感染细胞的吸附装置。家蚕NPV的DNA含量约占病毒粒子的10%左右，在电镜下观察到此双链DNA为松弛环状分子和线形分子，有的线形分子的长度可达10u_36u。并计算出家蚕NPV-DNA的分子量为75X 106d。我国各蚕区对家蚕脓病的防治采取了多种措施。①培育抗病性品种，因为蚕的种间和品种间对病毒病的抵抗力差异较大，而且此种抵抗力具有遗传性。②改善管理技术和饲料调剂，避免创伤感染，采用药剂预防。③研究化学防治。现有培育抗病性品种的方法有下述2种:
[0003](I)、2龄经口添食病毒法:2龄经口添食一定浓度的核型多角体病毒于桑叶上喂食24小时，72小时后调查死亡率，用半致死浓度指标调查抗病性。这种方法对抗性主基因的筛选固定有一定效果，但病毒浓度在15-1O9个/毫升仍然出现不同程度的死亡，对抗性微效基因筛选固定效果不明显，同时抗性易退化，很难实用化。家蚕对血液型脓病的抗性在整个龄期都处于一种侵袭和防御过程，体液、围食膜、血球细胞等对核型多角体病毒有抵抗和使病毒不活化作用。家蚕属完全变态昆虫，而这种生理变化在同一蚕品种的不同时期抗性将表现为一致性或不一致性。同时，病毒在蛹期具有侵染卵巢细胞致使核型多角体病毒垂直传递下代的可能性，致使下代1-2少量死亡，4龄开始爆发血液型脓病的可能性。现有方法选在2龄起蚕添食病毒，代表家蚕幼虫期的抗性水平。但家蚕在幼虫期根据发育快慢主要分2个时期:1-3龄为稚蚕期，发育较缓慢；4-5龄壮蚕期，生长发育快速。2个时期的生理变化极大，造成抗病在稚蚕期与壮蚕期发生显著变化。经试验调查，2龄起蚕添食病毒全抗单蛾，继续在4龄添食将发生不同程度的死亡，最大死亡率将超过50%以上，因此现有方法选在2龄起蚕添食病毒，只能代表在1-3龄稚蚕期抗病水平，不能代表家蚕整个幼虫期的抗性水平，更不能代表蛹期对病毒的抵御侵染，避免垂直传递的水平。用18个/毫升以上病毒浓度添食下筛选，这种方法能够保证抗性主基因的导入与纯合，在筛选过程中丢失了抗性微效基因，致使育成蚕品种在17个/毫升病毒浓度甚至更低浓度仍有5%左右的死亡率，难以培育出全抗血液型脓病蚕品种。
[0004](2)、利用生物工程的转基因手段培育家蚕抗血液型脓病蚕品种，该技术繁琐、耗时、耗物、实用性差，难以普及，未达到实用化。如申请号为200810024110.6，申请日为2008-04-30，名称为“对血液型脓病具有高抗性的转基因家蚕制作方法”的一篇中国发明专利申请，利用转基因的方法筛选家蚕品种转入的是抗性主基因的功能区段，可以获得高抗性个体，在群体中可以检测到千分之几的高抗个体，但是，高抗个体后代抗性难以固定，这是家蚕转基因方法目前遇到的瓶颈。又由于家蚕对血液型脓病的抗性是由I个主基因和多个微效基因共同控制的性状，因此转基因方法无法实现全抗性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种全抗家蚕血液型脓病的育种方法，实现对家蚕核型多角体病毒的全抗性。
[0006]本发明通过以下技术方案解决技术问题:一种全抗家蚕血液型脓病的育种方法，包括以下步骤:
[0007]第一步、将含有蚕核型多角体病毒的桑叶对蚕进行喂食，筛选得到病毒存活率达到50%以上，检测无多角体病毒的雌、雄蛾作为抗血液型脓病供体亲本；
[0008]第二步、将抗性供体亲本雄蛾与受体亲本雌蛾野B(来源于江苏科技大学蚕业研究所)杂交，得到含血液型脓病抗性基因的蚕种F1代，混合培育经2龄、4龄起的蚕，连续添食家蚕核型多角体病毒，筛选出抗性个体继代作为匕代；
[0009]第三步、对所述F2代的蚕种进行单蛾育，重复第二步方法，将单蛾育存活率50%以上的蚕留种继代作为F3代；
[0010]第四步、单蛾育50区，每个单蛾育区选择50头2龄起的蚕添食家蚕核型多角体病毒进行筛选，将50头全存活对应的单蛾区4龄起蚕全部添食家蚕核型多角体病毒，进行筛选，选留全存活的单蛾区留种继代作为匕代；
[0011]第五步、每个系统饲养10个单蛾区，以8个系统为宜，2龄起蚕每个单蛾区直接添食家蚕核型多角体病毒筛选，选留全抗单蛾区超过50%的系统，将其中所有全抗单蛾一直饲养至上蔟结茧，留种继代作为匕代；
[0012]第六步、每个系统饲养6个单蛾区，以8个系统为宜，2龄起蚕每个单蛾区直接添食家蚕核型多角体病毒筛选，调查选留全抗单蛾区100%的系统，将选出系统中的所有单蛾4龄起蚕继续添食家蚕核型多角体病毒筛选，得到全抗品系为匕代；
[0013]第七步、在F6-F7R不添食家蚕核型多角体病毒，进行常规饲养，在F8R，对2龄起蚕进行全部单蛾区添食家蚕核型多角体病毒，将单蛾区3-5头发病的系统淘汰，留下所有单蛾区100%无发病的系统，得到稳定的全抗系统，即为全抗家蚕血液型脓病的蚕种。
[0014]在上述方法的第一步中，抗血液型脓病供体亲本的筛选方法具体是:选择江苏科技大学蚕业研究所保存的强健性育种素材50份，每份28个单蛾混合收蚁2克，选择2龄起蚕2000头，将桑叶切成2厘米X 2厘米浸入含有家蚕核型多角体病毒的溶液，用蚕筷拣出已浸病毒的桑叶均匀添食，24小时后，添食正常桑叶饲养，3龄起蚕喂食2次桑叶后，将健康蚕用蚕筷拣出常规饲养，4龄起蚕将桑叶横竖两刀均匀切成4片，浸入含有家蚕核型多角体病毒的溶液，继续用蚕筷拣出已浸病毒的桑叶均匀添食，24小时后，添食正常桑叶饲养，4龄眠中、5龄起蚕及5龄中期淘汰病蚕，上蔟结茧后，雌、雄蛾对号交配，产卵I周后，60-650C烘蛾5小时，检测雌、雄蛾病毒多角体，将无病毒多角体的对应蚕种继代饲养，作为筛选出的抗性供体亲本匕1;按抗性供体亲本F M的筛选方法，对留选素材继续混合筛选，得到抗性供体亲本F。”再重复抗性供体亲本Fm的筛选方法，得到抗性供体亲本F。3，对2、4龄起蚕添食病毒存活率达到50%以上单蛾，雌、雄蛾检测无病毒多角体的蚕种，作为抗血液型脓病基因供体亲本。
[0015]所述含有家蚕多角体病毒的溶液浓度为18个/毫升，添食时间在2龄起蚕和4龄起蚕连续添食3次。18个/毫升病毒浓度在2龄、4龄添食50%存活结合雌、雄蛾多角体检测，能够保证1-3龄稚蚕期、4-5龄壮蚕期及蛹期抗性主基因均存在于供体亲本中。所述第二步至第七步，家蚕多角体病毒浓度为17个/毫升，有利于抗性主基因和抗性微效多基因同时保留，是筛选到抗性主基因和微效多基因最有效浓度。在第七步获得全抗家蚕血液型脓病的蚕种后，将单蛾育规模扩大到60区以上，2龄起蚕添食家蚕多角体病毒浓度为17个/毫升，无I头蚕发脓病，证明已筛选到抗性主基因和微效多基因。不同发育阶段的抗性稳定具体是用2龄、4龄连续添食病毒并结合雌、雄蛾检测方法，将雌、雄对号交配制种装盒后，在25°C下存放I周后，用60-65°C烘干5小时，显微镜调制放大倍数600倍检测雌、雄蛾病毒多角体，将雌、雄蛾均未检到多角体病毒的对应蛾区留种继代，培育出在1-3龄小蚕期、4-5龄大蚕期及蛹期不同发育阶段抗性稳定的蚕品种。
[0016]本发明的方法具有广谱性，一般育种单位均可实施，我国家蚕品种保存资源丰富，共有1000多份，一般育种单位均保存着一定数量的蚕品种资源，抗性基因存在于强健性蚕品种资源中，不同蚕品种抗性表现不一，经技术方案第一步方法一般育种单位能够从中筛选获得导入抗性基因亲本素材。受体亲本为需要改进的现行育成蚕品种，我国通过审定的育成蚕品种有100多个，根据育种部门需要改进的蚕品种不同而选择。
[0017]本发明中，以一只雌蛾所产的蚕卵为一个群体，计量单位为蛾或蛾区。以蛾区为单位分别饲养，称为蛾区育，也称单蛾育。I个蛾区有400——500粒蚕卵，饲养后可获得400多粒蚕茧。
[0018]本发明在育种早期世代用2龄、4龄连续添食含病毒的桑叶，添食病毒浓度的选择是基于家蚕对血液型脓病的抗性规律设置。受体家蚕品种存在丰富的抗性微效基因，在2龄起蚕17个/毫升病毒浓度添食下一般仍有5%左右的存活率，这些存活蚕是抗性微效基因作用的结果，如果在2龄起蚕18个/毫升及以上病毒浓度添食常规蚕品种，几乎无存活个体。因此，选用17个/毫升病毒浓度添食有利于抗性主基因和抗性微效基因的同时筛选获得全抗性，并结合雌、雄蛾检测病毒多角体，能够快速聚合抗血液型脓病基因，获得全抗单蛾及系统，实现育成蚕品种在1-3龄小蚕期、4-5龄大蚕期及蛹期的稳定抗病性能。其有益效果是:不仅能够获得高抗性个体，同时实现了对血液型脓病抗性主基因筛选固定和微效基因的筛选固定，筛选到在稚蚕期、壮蚕期及蛹期不同发育阶段抗性表现一致的抗性稳定蚕品种，实现家蚕对血液型脓病的全抗性。
【具体实施方式】
[0019]实施例
[0020]野三元蚕品种全抗血液型脓病培育，家蚕核型多角体病毒来源于江苏科技大学蚕业研究所病理研究室，蚕品种来源于江苏科技大学蚕业研究所育种研究室。按以下步骤进行:
[0021]第一步、抗血液型脓病供体亲本素材的筛选
[0022]1、抗性供体亲本FOl添食病毒筛选
[0023]选择江苏科技大学蚕业研究所保存的强健性育种素材50份，每份28个单蛾混合收蚁2克，2龄起蚕2000头，将桑叶切成2厘米X 2厘米浸入18个/毫升家蚕核型多角体病毒浓度的溶液，用蚕筷拣