一种花生网斑病抗病性鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种花生网斑病抗病性鉴定方法，属于作物抗病性鉴定技术领域。
【背景技术】
[0002] 叶斑病是花生上发生普遍、危害严重的一类病害，主要有花生褐斑病、黑斑病以及 近年新发生的花生网斑病，其中褐斑病与黑斑病常混合发生。叶斑病主要在花生生长的中、 后期发生，严重时引起叶片大量提早脱落。受害花生一般减产10~20%，严重的达40%以 上。然而化学药剂对花生叶部病害的防治效果不太理想，防效在60%左右，而种植抗病品种 (系）仍是防治花生叶部病害的有效方法。
[0003] 目前，花生网斑病仅依赖于田间自然发病进行鉴定，受自然气候及菌源约束较大， 且年季间差异较大。自然病圃通过人工创造发病条件和连年重茬种植虽可解决上述问题， 但受场地制约明显，不能大范围推广应用。并且花生网斑病原菌为花生茎点霉，室内培养 时在常规PDA上产孢慢（30天左右）且产孢量少，在燕麦培养基上产孢相对增多，但产孢 时间仍相对较长（20天以上），另外，由于其分生孢子器为埋生或半埋生，取孢难，且产孢量 对于田间接种鉴定来讲远达不到要求。非专利文献（《花生品种（系）对叶斑病的抗性鉴 定》）公开的一种了人工接种鉴定花生网斑病抗病性的方法，包括：春播花生，每个品种种植 2行，行长15m，每穴2粒，3次重复；田间管理为只浇水，中耕除草，不施用任何杀菌剂；接种 方法为：在室内培养基上诱发花生网斑病菌的分生孢子，制成孢子悬浮液，浓度为15X10 倍镜下约15个孢子，于7月10日傍晚喷雾接种；8月20日进行病害调查，每重复随机调查 30株，根据病级数据计算病情指数。然而由于作物品种的抗病性受到栽培、气象、病原菌致 病性等诸多因素的影响，仍有必要对上述供试品种进行异地鉴定，以验证其抗病稳定性。
[0004]花生育种目标要选择广适多抗品种，如能从人工接种方法进行突破，将极大地提 高花生品种对网斑病抗病性选育的效率，加快品种选育进程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种花生网斑病抗病性鉴定方法，该方法能够克服网斑病菌 产孢难、产孢慢、产孢量小、取孢难等问题，快速、准确地对育种材料进行网斑病抗病性鉴 定。
[0006]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0007]-种花生网斑病抗病性鉴定方法，包括以下步骤：将花生网斑病病原菌制成菌丝 悬浮液，喷雾接种花生幼苗（苗龄20~40天），待发病后（一般培养30~40天即可开始 调查）记录各植株的病级数并计算病情指数，评价花生品种对花生网斑病的抗病性。
[0008] 所述菌丝悬浮液的浓度为1.0X10 3~2. 0X103g(菌丝）/mL，菌丝长度100~ 200ym，直径6~8ym。菌丝悬浮液的制备方法为：将花生网斑病病原菌接种至PDA固体培 养基中（如每皿接3个直径0. 5cm的菌饼），在温度25~27°C、光暗周期12h光照/12h黑 暗条件下培养7~10天，刮取菌丝后加水研磨，再加入吐温-20,混匀即得。吐温-20的加入 量为研磨菌液总量的0. 1%~0. 2%，其目的为增加菌丝片段或孢子的分散性，以及悬浮液 在叶面上的附着能力。PDA固体培养基为：马铃薯、葡萄糖、琼脂与水按照质量比200:10~ 20:15 ~20:1000 配方。
[0009] 所述鉴定包括室内盆栽接种鉴定和田间鉴定，室内盆栽接种鉴定的条件为：温度 20~30°C，湿度95%以上；田间鉴定的条件为：通过灌溉控制环境温度20~35°C，湿度控 制以有晨露为准（控制土壤含水量在25 %左右，冠层的相对湿度> 90 % )，接种时选择无风 或风速小于2m/s的傍晚进行。
[0010] 所述病级数参照通用的花生叶斑病国际9级标准优化改良，病害分级标准如下：
[0011] 〇级：无病斑；
[0012] 1级：病斑面积不超过叶面积的10% ;
[0013] 2级：病斑面积不超过叶面积的20%;
[0014] 3级：叶片无病斑性脱落，病斑面积不超过叶面积的30%;
[0015]4级：叶片脱落不超过总叶片的10 %，病斑面积不超过叶面积的40 %;
[0016]5级：叶片脱落不超过总叶片的25 %，病斑面积不超过叶面积的50 %;
[0017]6级：叶片脱落不超过总叶片的50 %，病斑面积不超过叶面积的60 %;
[0018]7级：叶片脱落不超过总叶片的75 %，病斑面积不超过叶面积的75 %;
[0019] 8级：叶片脱落不超过总叶片的95 %，病斑面积不超过叶面积的95 %;
[0020] 9级：叶片脱落达95%以上，叶片全部有病斑。
[0021] 所述病情指数的计算公式如下：
[0022] 病情指数％ = 2 (病级值X相应病株数）八调查总株数\9)父100。
[0023] 所述抗病性评价标准可采用下述两种评价标准中的任意一种，当两种评价标准不 一致时，以病种的级别或指数为准进行判定。
[0024] 按病级评价标准：0级，免疫（I) ;1级，高抗（HR) ;2级、3级，抗（R) ;4级、5级、6 级，中抗（MR) ;7级、8级，感⑶；9级，高感（HS)。
[0025] 按绝对病指数（无统一标准）：0,免疫；> 0且彡10%，高抗；> 10 %且彡30%， 抗；> 30%且彡70%，中抗；> 70%且彡90%，感；> 90%且彡100%，高感。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 本发明采用花生网斑病菌丝悬浮液接种花生幼苗，能够克服网斑病菌产孢难、产 孢慢、产孢量小、取孢难等问题，无需等待产孢，可快速、准确地对育种材料进行网斑病抗病 性鉴定。该方法可大量扩繁病原菌丝，不受时限批量生产，相较分生孢子鉴定法（目前仅 能做小批量盆栽鉴定，而不能大规模地应用于田间材料的筛选），周期短，占用资源少，成本 低，操作简便，适用于室内盆栽和田间花生材料的抗病性鉴定，克服了田间自然发病受气候 约束，不发病或发病不匀的弊端，增加对材料选育的准确性，有利于加快抗病育种进程。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例中花生网斑病抗病性鉴定方法，包括以下步骤：
[0031] 1)制备花生网斑病菌丝悬浮液
[0032] 将花生网斑病病原菌接种至PDA固体培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂与水的质量 比为200:20:18:1000)上，每个培养皿分散接种3个直径0. 5cm的菌饼，在26 ±1°C光照培 养箱内光暗交替培养（12h光照/12h黑暗）8天，至菌丝长满整个培养基，刮取菌丝并将其 装入盛有玻璃珠的2mLPE离心管中，在离心管内加入200yL无菌水，于BulletBlender STORM研磨仪（NextAdvance) 8档研磨45s，镜检菌丝长度100~200ym，直径6~8ym， 取出研磨液并稀释至菌丝浓度为I. 6X10 3g/mL，按0. 15%加入吐温-20后摇匀备用；
[0033] 2)接种菌丝并培养
[0034] 将菌丝悬浮液置于IOOmL喷壶中，喷雾接种苗龄20天的花生幼苗（豫花22号，夏 播生育期113天，室内盆栽接种15株），整株喷施并采用薄膜罩保湿（12h光照不保湿和