火焰树愈伤组织的诱导方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物培养领域，具体地涉及一种火焰树愈伤组织的诱导方法。
【背景技术】
[0002] 火焰树（Spathodea campanulata Beauv)为紫葳科火焰树属高大乔木，树冠伞形、 圆锥形，树姿婆娑，羽叶茂盛，树形优美。开花时花多而密集、花大、花色猩红、花色艳丽，花 开于树冠之上，有极高的观赏价值，是良好的风景园林观赏树种。原产于热带非洲地区。现 在广泛栽培于印度、斯里兰卡等，我国广东、福建、台湾、云南等地区也均有栽培。火焰树常 规的繁殖方法主要采用播种、扦插、嫁接等方法。但采用这些方法存在成苗生长周期长、成 型慢、种子发芽率低、出苗率不稳定等问题，无法满足生产和市场的需求。因此，探索火焰树 快速繁殖的有效途径已成为亟待解决的问题。
[0003] 植物组织培养具有繁殖速度快、繁殖系数大、后代整齐一致，能保持原有品种的优 良性状、可获得无毒苗、可进行周年工厂化生产、经济效益高等优点，但植物的组织培养涉 及多方面的因素、影响因子多，形成一套完整的工艺不易。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种火焰树愈伤组织的诱导方法，以解决现有技术中存在 的上述问题。
[0005] 本发明提供的技术方案如下：
[0006] -种火焰树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
[0007] 1)取火焰树花瓣在洗衣粉溶液浸泡后流水冲洗，然后转置超净工作台依次用酒 精、升汞、次氯酸钠灭菌处理，其中用70-80%酒精浸泡25-35s，转至0. 1~0. 2%HgCl2 5~ 12min后，无菌水漂洗3-5次，再用1 % NaCIO浸泡1~8min后，无菌水漂洗2-4次；每次无 菌水漂洗时间为l_3min ;无菌蒸馏水洗净后获得消毒的火焰树外植体。
[0008] 2)愈伤组织诱导培养：取步骤1)已消毒的外植体切成0. 4-0. 6cm*0. 4-0. 6cm 大小接种于愈伤诱导培养基中，培养条件为：光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/ d，温度25±2°C，pH = 5. 8,所述诱导培养基，按每升计算，含有400mg NH4N03、556mg Ca(N03)2*4H20、990mg K2S04、96mg CaCl2*2H20、170mg KH2P04、0.25mg Na2Mo04*2H20、 370mg MgS04 · 7H20、22. 4mg MnS04 · H20、8. 6mg ZnS04 · 7H20、0. 25mg CuS04 · 5H20、27. 8mg FeS04 ·7Η20、37. 3mg Na2MoEDTA、100mg 肌醇、1. Omg 维生素 B1、0. 5mg 烟酸、0. 5mg 维生素 B6、 2.0mg甘氨酸20-30g蔗糖、7-9g琼脂、诱导培养基中添加0. l-2.0mg2,4-D、0. l-2.0mg NAA、 0. 2mg VC〇
[0009] 3)愈伤组织增殖培养条件为：取步骤2)所得的初代愈伤组织转接于继代培 养基中，培养条件为温度25±2°C，pH = 5. 8,先暗培养0-7d，然后正常光培养，光照强 度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，温度25 ± 2 °C，所述增殖培养基，按每升计算，含有 200mg NH4N03、668mg Ca(N03)2.4H20、990mg K2S04、170mg KH2P04、0.25mg Na2Mo04.2H20、 370mgMgS04 · 7Η20、22· 4mg MnS04 · Η20、8· 6mg ZnS04 · 7Η20、0· 25mg CuS04 · 5Η20、27· 8mg FeS04 ·7Η20、37· 3mg Na2MoEDTA、100mg 肌醇、L Omg 维生素 B1、0. 5mg 烟酸、(λ 5mg 维生素 B6、 2. Omg甘氨酸、lOOmg水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g琼脂，增殖培养基中添加 1. 0mg2, 4-D、 0.5-1. Omg NAA^〇-〇. 2mgVC〇
[0010] 其中，步骤1)外植体为火焰树长势饱满未开放花瓣；须经洗衣粉溶液浸泡预处 理。
[0011] 其中，步骤1)中，外植体预处理后优选的灭菌处理方法为洗衣粉溶液浸泡15min， 再流水冲洗2h，之后用75%酒精浸泡30s，转至0. 2% HgCl28min后，无菌水漂洗4次，再用 1 % NaCIO浸泡8min后，无菌水漂洗3次。该优选处理条件下获得的外植体成活率最高、同 时污染率和褐化率都很低。
[0012] 其中，步骤2)花瓣愈伤组织诱导培养基优选为：按每升计算，含有400mg ΝΗ4Ν03、 556mg Ca(N03)2 *4H20^990mg K2S04^96mg CaCl2 *2H20^ 170mg KH2P04^0. 25mg Na2Mo04 *2H20^ 370mg MgS04 · 7H20、22. 4mg MnS04 · H20、8. 6mg ZnS04 · 7H20、0. 25mg CuS04 · 5H20、27. 8mg FeS04 ·7Η20、37· 3mg Na2MoEDTA、100mg 肌醇、L Omg 维生素 B1、0. 5mg 烟酸、(λ 5mg 维生素 B6、 2. Omg甘氨酸、20-30g鹿糖、7-9g琼脂。诱导培养基优选添加 1. 0mg2, 4-D、l. Omg ΝΑΑ、0· 2mg VC 〇
[0013] 其中，步骤3)花瓣愈伤组织增殖培养基优选为：按每升计算，含有200mg ΝΗ4Ν03、 668 mg Ca(N03)2.4H20、990mg K2S04、170mg KH2P04、0.25mg Na2Mo04.2H20、370mgMgS04.7H 20、 22. 4mg MnS04 · H20、8. 6mg ZnS04 · 7H20、0. 25mg CuS04 · 5H20、27. 8mg FeS04 · 7H20、37. 3mg Na2MoEDTA、lOOmg 肌醇、1. Omg 维生素 B1、0. 5mg 烟酸、0· 5mg 维生素 B6、2. Omg 甘氛酸、lOOmg 水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g琼脂、增殖培养基中优选添加1. 0mg2, 4-D、1. Omg NAA、 0. 2mgVC、培养条件为先暗培养7d，然后正常光照培养。
[0014] 本发明以火焰树的花瓣为外植体，首先采用步骤1)的外植体灭菌方法，获得成活 率高（可达73. 4% )、褐化率低（6. 8% )、污染率较低（19. 8% )的外植体，再综合筛选得到 附加不同激素及其浓度配比的花瓣愈伤组织启动培养及增殖培养基配方，以及光照等多方 面因素，最后可以获得愈伤组织诱导率可达83. 3 %，增殖率达100%，解决了火焰树离体培 养中外植体污染率高、愈伤组织诱导率低这一技术难题，为火焰树组培快繁和品种改良奠 定基础，本发明方法可以为火焰树的遗传转化及工厂化育苗提供技术支持。
【附图说明】
[0015] 图1为花瓣愈伤组织启动培养实物图之一；
[0016] 图2为花瓣愈伤组织启动培养实物图之二；
[0017] 图3为花瓣愈伤组织增殖培养实物图之一；
[0018] 图4为花瓣愈伤组织增殖培养实物图之二；
[0019] 图5为继代培养的愈伤组织培养实物图之一；
[0020] 图6为继代培养的愈伤组织培养实物图之二。
【具体实施方式】
[0021] 以闽南师范大学校园里长势良好、无病虫害的火焰树植株的花瓣为试验材料。
[0022] 实施例1外植体灭菌
[0023] 选取长势饱满未开放的火焰树花瓣作为外植体。先用市售洗衣粉浓溶液5g/L浸 泡15min后，于流水中冲洗2h，再转至超净工作台，将外植体进行灭菌操作。具体操作见表 1 (HgCl2处理后无菌水漂洗4次，每次2min ;NaC10处理后，无菌水漂洗3次，每次2min)。 灭菌操作完，将花冠切成0. 5cm*0. 5cm大小转接到相应的培养基上，每处理接种30瓶，每瓶 1-3个材料，重复3次。15d后观察统计不同外植体的灭菌效果。根据材料的污染率、褐化 率、成活率判断灭菌方法的优劣。其中，污染率=接种污染数/接种总数X100% ;褐化率 =褐化数/接种总数X 100% ;成活率=无污染、褐化数/接种总数X 100%。
[0024] 表1外植体灭菌处理
[0026] 外植体经过灭菌处理后，接种在相应培养基上，观察统计其污染率、褐化率、成活 率及生长情况。试验结果见表2。
[0027] 表2不同消毒处理对外植体灭菌效果的影响
[0029] 由表2可知，火焰树花瓣灭菌处理中效果最好的是处理7,其成活率最高，达 73. 4%，褐化率为6. 8%，污染率较低，为19. 8 %，愈伤生长良好。其次是处理8,成活率达 66. 2%，但其褐化率为16. 6%，污染率为18. 3%与处理7相差0. 5% ;灭菌效果最差的为处 理1及处理4,其成活率均为10. 1 %。从表1和表2,可看出外植体灭菌处理中，随着HgCl2浓度的提高、处理时间的延长，污染率随之下降，但褐化率升高。取(：12与NaCIO组合处理， 灭菌效果比单独使用好。因此根据结果及外植体生长情况认为火焰树外植体花瓣的最佳灭 菌方法为：洗衣粉溶液浸泡151^11-流水冲洗211 - 75%酒精3〇8 - 0.1%取(：1281^11-无 菌水漂洗4次一1 % NaCIO 8min -无菌水漂洗3次。
[0030] 实施例2启动培养
[0031] 本方法以火焰树花瓣为外植体，进行花瓣愈伤组织诱导培养；
[0032] 以含有以下成分的培养基为诱导培养基：400mg/L NH4N03、556mg/ L Ca(N03)2*4H20、990mg/L K2S04、96mg/L CaCl2*2H20、170mg/L KH2P04、0.25mg/L Na2Mo0