骨髓间充质干细胞保存液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞保存液技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞保存液及其应 用。
【背景技术】
[0002] 干细胞治疗是将具有不断自我繁殖能力和多向化潜能的干细胞在体外培养后，再 将其移植入患者受损或缺损组织，从而实现对损伤组织的补充和修复。而目前能实现人骨 髓间充质干细胞分离并大规模培养的细胞很少，在细胞培养完成之后，同时还需要对细胞 进行表型检测、细胞形状分析等等，之后将细胞保存在保存液中，待需要时再进行输注。在 人骨髓间充质干细胞培养后进行保存的阶段中，既要维持细胞的基本生命代谢以防止其死 亡，同时又要避免其代谢量过大而继续大量增殖产生的大量形状变异。所以细胞保存中，都 采用0.9WT%氯化钠注射液、5WT%葡萄糖注射液、复方电解质注射液（Plasmalyte A)、l~ 5WT %人血白蛋白溶液等作为细胞的保存介质来进行。
[0003] 但是细胞保存的过程中，采用上述骨髓间充质干细胞的保存液进行保存，在需要 保存时间较短时（4h内）细胞的性质和变化还能维持在比较正常的水平，细胞活性降低的 程度还不会大幅降低治疗的品质。但是如果保存的时间上进一步增加，进行稍长时间的保 存时，首先细胞具有表型异变、活性降低、聚集成团等倾向和性状变化更加明显，这些都会 降低细胞的品质影响治疗的效果，而上述保存液本身不具有缓解或者降低这些保存过程中 问题的能力；并且上述保存液本身营养配比不适当、成分比较单一、细胞外环境渗透压维持 不够力度，也不太能满足稍长时间保存的要求；同时保存液还不具有抵抗外界污染的能力， 遇到污染时骨髓间充质干细胞不具有良好的竞争性抑制能力。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有通常骨髓间充质干细胞保存液的缺陷，提供一种 能较好地保持细胞活性，并减缓和修复细胞损伤的骨髓间充质干细胞保存液。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种骨髓间充质干细胞保存液，该骨髓间充质干细胞保存液为含有1. 5~3WT % 肝素、0. 5~1. 5WT %透明质酸和1~3WT %海藻糖的基础液；
[0007] 其中，所述基础液为包括1. 5~2. 5mmol/L的L-谷氨酰胺、20~30mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸）、0. 6~1. 4mmol/L丙酮酸钠以及90~110mg/L硫酸庆大霉 素的水溶液。
[0008] 本发明的上述骨髓间充质干细胞保存液，以基础液作为保存液的基础，提供基本 的必要营养成分以维持细胞基本的生命代谢，使细胞的代谢程度处于基本的稳定状态；并 且基础液多用非离子性缓冲维持稳定的渗透压和电荷强度，从而进一步降低细胞性状变化 的可能。之后再采用添加的肝素、海藻糖和透明质酸的添加成分，进一步对细胞在保存中产 生的损伤或者是表型异变等进行修复、以及抑制细胞的成团，用以减少细胞损伤并加强细 胞活性的维持效果，从而实现在细胞性状和活性良好保持下进行保存。
[0009] 在上述骨髓间充质干细胞保存液的基础上，本发明进一步还提出将其进行骨髓间 充质干细胞保存的应用。采用本发明的保存液进行保存的过程中，使骨髓间充质干细胞维 持在比较稳定的代谢状态，且能尽量降低或者减缓在保存过程中出现的细胞损伤的程度， 并且能抑制低水平代谢容易引发的休眠和凋亡的倾向，最终在保存之后能得到活性更好的 细胞。
【具体实施方式】
[0010] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0011] 本发明实例提出一种骨髓间充质干细胞保存液，其成分为含有1. 5~3WT%肝素、 0. 5~1. 5WT %透明质酸和1~3WT %海藻糖的基础液；
[0012] 其中，基础液为包括1. 5~2. 5mmol/L的L-谷氨酰胺、20~30mmol/L HEPES(4-羟 乙基哌嗪乙磺酸）、〇. 6~1. 4mmol/L丙酮酸钠以及90~110mg/L硫酸庆大霉素的水溶液。
[0013] 本发明的上述骨髓间充质干细胞保存液，以基础液作为保存液的基础，提供基本 的必要营养成分以维持细胞基本的生命代谢，使细胞的代谢程度处于基本的稳定状态；并 且基础液多用非离子性缓冲维持稳定的渗透压和电荷强度，从而进一步降低细胞性状变化 的可能。之后再采用添加的肝素、海藻糖和透明质酸的添加成分，进一步对细胞在保存中产 生的损伤或者是表型异变等进行修复、以及抑制细胞的成团，用以减少细胞损伤并加强细 胞活性的维持效果，从而实现在细胞性状和活性良好保持下进行保存。
[0014] 在本发明的上述基础上，基础液中的成分根据细胞保存过程中所需的细胞的基本 生命代谢的营养要求以及保存过程能利于细胞性状维持的功能需要进行成分选定。首先， L-谷氨酰胺（L-glutamine)在氨基酸组分中的有重要作用，谷氨酰胺可以合成核酸和蛋白 质，是细胞生长必需成分，而谷氨酷胺缺乏会使细胞生长不良甚至导致细胞死亡。所以本 发明在保存液中添加一定浓度的L-谷氨酰胺，在保存中满足细胞基本代谢所需的谷氨酷 胺，维持代谢活动处于相对较低的水平，避免胁迫式的进行大量代谢，反而会大大缩短组织 细胞的寿命和活性。同时，本发明中添加 L-谷氨酰胺的目的还在于，其在机体内能参与消 化道黏膜黏蛋白构成成分氨基葡萄糖的生物合成，从而促进黏膜上皮组织的修复；对其功 能跟踪发现用于体外之后其可以有助于细胞膜结构的补充和修复功能，避免细胞的裂解死 亡；所以，在本发明保存液中使用还能借助其进行细胞膜的修复功能。
[0015] 进一步，基础液中的丙酮酸钠作为维持基本的能量物质，是一种糖代谢的底物。原 本对于人骨髓间充质干细胞来说，一般情况下培养或者保存时给定的能源物质一般都是葡 萄糖，相比细胞保存的要求，保存过程中所需的细胞代谢途径尽量不要过于复杂，以免容易 导致诱发细胞产生性状变异；所以，在实验对比之后，采用丙酮酸钠进行基础能源物质来维 持细胞的基本代谢要求。
[0016] 同时，基础液中的硫酸庆大霉素是一种碱性的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革 兰阴性菌及阳性菌都具有抑菌和杀菌作用。对绿脓杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌、沙门氏菌属、 大肠杆菌及变形杆菌等革兰阴性菌和金葡菌等作用较强。本发明在基础液中添加硫酸庆大 霉素可以防止在保存下中极有可能发生的细菌污染，提升干细胞在受到污染时的竞争性优 势。并且，本发明中采用硫酸庆大霉素作为抗生素的原因还在于其是氨基糖苷类物质，是常 用的静态抗菌素，相比双抗的青霉素和链霉素，其稳定性更强；添加双抗之后，青霉素在4 度温度下1~2天后基本就完全降解失效了，而且抗生素种类越多越容易引起细胞的形态 改变，这对于本发明提升骨髓间充质干细胞的保存品质是不利的，所以，在机理对比和反复 试验考量之后，本发明采用添加90~110mg/L的硫酸庆大霉素进行。
[0017] 同时，在上述三种基础液成分确定之后，基础液中进一步添加20~30mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸），HEPES是一种非离子两性缓冲液，相比离子型的磷酸盐缓冲 液，缓冲效果更加稳定一些；自身有利于保持保存液渗透压的持久稳定。
[0018] 整体上，由于细胞一般比较通常所最适的渗透压耐受范围260~320mmol/L，同时 结合本发明中细胞保存中各成分所起的功能，所以调整各成分的浓度为上述描述的浓度。
[0019] 进一步在基础液的基础上，其中还添加有三种细胞功能成分，其中，肝素具有抗炎 生物活性，可以使之能够对抗细胞保存过程中引起细胞损伤的炎性因子的作用，一方面可 以抑制细胞损伤的进一步加深、另一方面利于修复。同时，肝素本身也是一种糖胺聚糖，其 分子表面丰富的电荷可能使其与细胞膜表面产生相互作用而起到一定的稳定作用，减少细 胞损伤。而海藻糖是由两个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，其能在细胞表面 能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和 生物特征，在细胞的保存过程中，可以抑制细胞在非大量代谢情形下的退化和凋亡。最终， 透明质酸增加溶液黏性，使保存液溶液胶体渗透压也增加，从而防止细胞易出现的破裂状 态，为细胞的活性状态的维持也提供了基础。所以，这三种细胞功能成分，结合基础液得到 的本发明上述骨髓间充质干细胞保存液，具有更强的细胞生命活性保持能力，同时保存液 自身的渗透压等等参数的稳定保持上能更加长久，避免了保存液自身环境易于改变而引起 的细胞性状变化缺陷。
[0020] 基于上述保存液的成分，在实施的过程中，虽然骨髓间充质干细胞的代谢状态基 本维持在基础生命代谢程度，而不存在其他的功能代谢，但是由于本身营养成分种类和量 都较低，保存的过程中半饥饿状态的细胞会慢慢向休眠或者凋亡进行转变；所以在实施的 过程中可以在基础液中添加0. 08~0. 12mmol/L非必需氨基酸；非必需氨基酸的添加可以 有助于完善基本营养成分，补充代谢过程，抑制细胞休眠或者凋亡。当然，对于人骨髓间充 质干细胞的基本代谢来说，非必需氨基酸的种类比较多（有十多种），种类越多越容易诱发 细胞产生多样性变化，选择少数几种即可。本发明实施例优选选择半胱氨酸和/或酪氨酸 等半必需氨