一种冷冻保存液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及冷冻保存，尤其是氧化石墨烯在生物材料冷冻保存中的应用，以及一 种含有氧化石墨烯的冷冻保存液，该保存液的制备方法，和应用该保存液进行细胞、组织或 器官冷冻保存的方法，属于生物材料冷冻保存技术领域。
【背景技术】
[0002] 低温或者超低温保存技术是20世纪70年代迅速发展起来的一种在干冰或者液氮 的条件下保存生物组织、器官和细胞等生物材料的技术。在低温条件下，生物组织处于"休 眠的状态"，保证了生物材料的遗传和形态稳定性，是一种有效保存生物材料的方法。近几 十年里，该项技术的应用集中在具有经济价值的哺乳类、禽类、鱼类等动物以及各种植物的 研究领域。低温、超低温保存作为一项新兴技术，不仅促进了生物学、医学等基础学科的发 展，也在农业、畜牧业、养殖业等领域发挥了极大的作用，产生了极大的经济效益。
[0003] 然而，在复苏过程中，冷冻保存液中所含的冰晶会持续生长，而冰晶损伤是冷冻保 存技术中对保存对象最主要的伤害，是由于抗冻保存液或细胞内的水分形成冰晶，刺伤细 胞导致的。
[0004] 冷冻技术领域目前已发展出了程序冷冻法和玻璃化冷冻法，其中后者利用高浓度 的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则的玻璃化固体，不形成冰晶，从而使细胞在 剧烈的快速降温中得到保护，来克服冰晶损伤，但是，玻璃化样品在复苏过程中依然会产生 大量的冰晶。目前主要是通过调整冷冻保存液的组成，例如使用渗透性抗冻剂（如甘油、 DMS0等）和非渗透性抗冻剂（如聚乙二醇、PVP等），以及调控冷冻降温程式的方式，来尽 量减少冰晶的形成。
[0005] 氧化石墨烯是一种以重复不饱和六元碳环为骨架的两亲性二维材料，其表面分布 着含氧官能团和完整石墨烯区域。氧化石墨烯可如同界面活性剂一般存在界面，并降低界 面间的能量。目前氧化石墨烯在聚合物类复合材料以及无机物类复合材料领域的应用逐渐 广泛起来。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明人研究发现，氧化石墨烯能稳定地分散在液体中，并且能抑制冷冻 和/或复苏过程中冰晶的生长。在此基础上，本发明保护以下技术方案：
[0007] 氧化石墨烯用于抑制冷冻保存液冷冻和/或复苏过程中冰晶的生长。优选所述的 冷冻和/或复苏过程是生物材料的冷冻和/或复苏。
[0008] 氧化石墨烯在制备冷冻保存液中的应用。优选所述的冷冻保存液是用于生物材料 的冷冻保存。
[0009] -种冷冻保存的方法，其特征在于，在冷冻保存液中添加氧化石墨烯。优选所述的 冷冻保存方法是生物材料的冷冻保存方法。
[0010] -种含有氧化石墨烯的冷冻保存液。
[0011] 下面详细说明本发明所要保护的技术方案。
[0012] 可用于本发明的"生物材料"包括但不限于：细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺 旋体，来源于人体、动物和植物的细胞、组织、器官，以及通过生物工程技术获得的细菌、真 菌、病毒、藻类、细胞和组织。总之生物技术及相关领域中所有能够冷冻保存，以及需要冷冻 保存并复苏的生命材料都包涵在本发明"生物材料"的范畴内。在一些实施例中，生物材料 可以是天然存在的细菌或者通过生物工程技术获得的工程菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、金 黄葡萄球菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等；在一些实施例中生物材料可以是来源于人体、动物 和植物的细胞，或者通过细胞工程技术获得的工程细胞，例如动物或人体的肝细胞、生殖细 胞、神经细胞、肌纤维细胞、上皮组织细胞，植物的根细胞、叶细胞，或者各种肿瘤细胞或杂 交瘤细胞，例如Hela细胞、SHG-44胶质瘤细胞、A549细胞等；在一些实施例中生物材料可 以是来源于人体或动物的组织或器官，或者通过组织工程技术获得的组织，例如皮肤组织 或皮肤工程组织、软骨组织、骨组织或骨工程组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织、肾脏、肝 脏、角膜、心脏、肺等。在本发明的一些实施例中生物材料是造血干细胞，软骨组织，肾脏器 官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的精子。
[0013] 可用于本发明的"冷冻保存液"是在冷冻保存过程中用于悬浮生物材料的各种溶 液，例如：10~50 %的甘油，添加有甘油、DMSO、PVP或者聚乙二醇等抗冻剂的生理盐水、 Hank's液、DMffl培养液、RPMI-1640培养液或各类细菌培养基等，也可以是Hank's液、DMEM 培养液、RPMI-1640培养液或各类细菌培养基等。
[0014] 氧化石墨烯抑制冰晶生长的作用主要基于其结构和化学性质，氧化石墨烯上的含 氧官能团中的羟基可以有效地与冰晶相互结合，阻止水分子向冰晶界面上的扩散，从而抑 制冰晶的生长。基于此，本领域技术人员可以预期，各种来源的氧化石墨烯都能用于抑制冷 冻和/或复苏过程中冰晶的生长，用于生物材料的冷冻保存，并且将氧化石墨烯加入到各 种冷冻保存液中，可以通过抑制冷冻保存液和生物材料内部的水分冰晶生长，进一步提高 冷冻保存液的冷冻保存效率。
[0015] 可用于本发明的氧化石墨烯可以通过商购的方式获得，例如Sigma-Aldrich Co. LLC.销售的产品编号为763713、763705和777676的氧化石墨烯水分散液，也可以采用 氧化石墨烯的常规方法制备得到，如Hmnmers法氧化石墨后剥离来获得。
[0016] 在本发明中，氧化石墨烯的碳氧元素比是指碳氧元素的摩尔比。
[0017] 优选用于本发明的氧化石墨稀为片状材料，其尺寸为200nm-12 μ m，优选为200~ 500nm ;层数为1~3层，优选为1~2层；碳氧元素比1. 5~2. 2:1，优选约为1. 9:1。
[0018] 优选氧化石墨烯在冷冻保存液中的质量百分比浓度为0.001%~2%，优选为 0. 01 %~1 %，进一步优选为0. 05~0. 5 %，更优选为0. 08~0. 3 %，最优选约为0. 1 %。
[0019] 本领域技术人员也可以根据所冻存或培养的生物材料的特点，在冷冻保存液中添 加其他化学成分，例如糖、血清白蛋白等蛋白质、生长因子等功能性多肽或蛋白质、生理可 接受的缓冲体系、无机电解质等。
[0020] 本发明还进一步提供了一种具体的冷冻保存液，以每升水计，含有0. 3~0. 7g葡 萄糖、7~10g乳糖、0. 1~0. 5g棉籽糖、0. 9~1. 3g 4-轻乙基哌嗪乙磺酸、2. 0~5. 0g磷 酸盐缓冲对、1~2g氯化钠、2~4g氯化钾、0. 01~0. 04g硫酸镁、0. 05~0. lg氯化钙、 〇. 5~lg酪蛋白，冷冻保存液的pH值为6. 9~7. 5,优选为7. 1~7. 3。
[0021 ] 所述的磷酸盐缓冲对是由磷酸盐的共辄酸碱对组成，所述磷酸盐可以是磷酸的碱 金属盐，例如磷酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾；磷酸 的碱土金属盐，例如磷酸钙、磷酸二氢钙、磷酸氢钙、磷酸三镁、磷酸一镁、磷酸二镁；磷酸的 铵盐，例如磷酸氢二铵、磷酸二氢铵等。所述磷酸盐可以是无水物或不同水合度的水合物。
[0022] 优选所述的磷酸盐缓冲对组成为：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠和磷酸 三钠，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，磷酸氢二钾和磷酸三钾，磷酸氢二铵和磷酸二氢铵。最优 选为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。
[0023] 所述的冷冻保存液中，含有葡萄糖、乳糖、棉籽糖等糖类，能够为生物材料提供外 源能量，形成糖衣保护，防止冷冻条件下外界环境对生物材料细胞膜的损伤。含有HEPES、磷 酸盐、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙等物质，为生物材料的保存提供适宜的渗透压环境和 适宜的酸碱度。所述冷冻保存液适用于各类动物和植物的细胞和组织、器官的冷冻保存，本 领域技术人员可以根据需要在上述含量范围内调整冷冻保存液的配方。
[0024] 优选，所述冷冻保存液含有如下组分：以每升水计，约0. 5g葡萄糖、约9. 0g 乳糖、约〇.3g棉籽糖、约1. lg 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、约1.2g NaH2P04· 2H20、约1.6g Na2HP04 · 2H20、约1. 5g氯化钠、约3. 0g氯化钾、约0. 02g硫酸镁、约0. 07g氯化钙、约0. 6g 酷蛋白。
[0025] 所述冷冻保存液的制备方法是：将各组分按照用量称取后，加入到去离子水中，充 分混合溶解后，采用常规的除菌或灭菌的方法，例如超滤除菌法，除菌之后放置于4°C冷藏 避光保存。
[0026] 除上述的各组分之外，为增强冷冻保存效果，也可以在所述冷冻保存液中加入目 前市场上经常使用的抗冻剂如甘油、DMS0等，也可以加入氧化石墨烯，以进一步提高其冷冻 保存的效果。
[0027] 在冷冻保存液中添加氧化石墨烯的方法，可以是称取相应量的氧化石墨烯，物理 破碎后研磨成细末，将氧化石墨烯的细末超声分散到冷冻保存液中；或者根据要添加的氧 化石墨烯的用量，将适当体积的已知浓度的氧化石墨烯水分散液加入冷冻保存液中混匀即 可。
[0028] 优选所用的氧化石墨稀为片状材料，其尺寸为200nm-12 μ m，优选为200~500nm ; 层数为1~3层，优选为1~2层；碳氧元素比1. 5~2. 2:1，优选约为1. 9:1。
[0029] 优选氧化石墨烯在冷冻保存液中的质量百分比浓度为0.001%~2%，优选为 0. 01 %~1 %，进一步优选为0. 05~0. 5 %，更优选为0. 08~0. 3 %，最优选约为0. 1 %。 [0030] 使用本发明提供的冷冻保存液对生物材料进行程序冷冻时，操作步骤可以如下：
[0031] (1)将生物