材料，例如细胞悬浮液、组织或器官加入到适量的冷冻保存液中，针对 于器官，根据需要还可将冷冻保存液灌注其中，然后将生物材料转移至恒温箱，使得温度降 至3~6°C，优选为5°C，在该温度下维持60~120分钟，优选90分钟。
[0032] (2)采用程序控温的方式使得保存液体系温度以20~60°C /min的速度降 至-140°C，将降温后的保存液体系置于液氮罐中，通过液氮进行保存。优选以40°C /min的 速度降至-110°C，再以20°C /min降至-140°C。
[0033] 低温保存后的生物材料，在37°C环境中复苏，平衡过程中利用摇床轻轻震荡，然后 将冻存管或其他生物材料培养容器置于室温条件下，轻轻震动至完全融解。
[0034] 本发明的优点在于：
[0035] 氧化石墨烯是片状二维材料，其表面分布的含氧官能团使得氧化石墨烯较易在水 中分散。在水中，氧化石墨烯能够进行水合进而带负电，这种负电性的氧化石墨烯能够克服 片层与片层之间的范德华力和氢键相互作用，保证了氧化石墨烯分散液的稳定性。并且， 石墨烯的晶格结构与、型的冰晶具有完美的晶格匹配，为氧化石墨烯抑制冰晶生长提供了 可能性，这种抑制冰晶生长的作用主要基于氧化石墨烯特殊的结构和化学性质，氧化石墨 烯上的含氧官能团形成团簇分布在片层上，完整的石墨烯结构也集中分布，因此整个石墨 烯片层应该是含氧官能团和完整石墨烯片层的混合状态。而含氧官能团中的羟基与水分子 有非常强的相互作用，可以有效的与冰晶相互结合，而厌水的氧化石墨烯片层在冰晶形成 后可以被水分子排开，从而可以更好的与冰晶结合。再者，完整的氧化石墨烯与Ih型冰晶 的basal面有非常好的匹配效果，因此在生物材料冷冻和/或复苏的过程中，一旦冰晶形成 后，二维的氧化石墨烯就会牢牢的吸附在冰晶的界面上，阻止水分子向冰晶界面上的扩散， 从而抑制冰晶的生长。氧化石墨烯对冰晶的抑制作用，有效的减少了由于冰晶的生长对生 物材料细胞刺破的危害。并且氧化石墨烯具有较高的比表面积，在冷冻保存液体系中使用 很少的量就能起到有效抑制冰晶生长的作用，而且具有普适性。
[0036] 另外，氧化石墨烯分散在冷冻保存液中，不是真溶液，在后期复苏去除时，通过离 心或沉降的方式很容易剔除，比DMS0等常规抗冻剂操作简便。
【附图说明】
[0037] 图1冷冻保存液中分散的氧化石墨烯的原子力图
[0038] 图2冷冻保存液中分散的氧化石墨烯的粒度分布
[0039] 图3冷冻保存液中分散的氧化石墨烯的厚度分布。所述厚度显示分散在冷冻保存 液中的氧化石墨烯是单层的。
[0040] 图4水中及氧化石墨烯水分散液中冰晶生长图。左图是水中冰晶生长图，右图是 氧化石墨烯水分散液中冰晶生长图。
[0041] 图5不同样品对马精子冷冻复苏的效果统计图
[0042] 图6含有不同浓度氧化石墨烯冷冻保存液对精子冷冻保存的影响统计图
【具体实施方式】
[0043] 以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发 明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在 本发明的保护范围之内。
[0044] 实施例1
[0045] 氧化石墨烯的制备
[0046] 1、预氧化石墨
[0047] 称取2. 5g的五氧化二磷和2. 5g的过硫酸钾，加入至250mL锥形瓶中。在不断搅 拌的情况下加入20mL浓硫酸，加热至80°C后，向溶液中缓慢加入3g石墨粉，保持溶液的温 度在80°C达4. 5h后冷却到室温。之后缓慢加入去离子水，这个过程中保证溶液的温度不超 过80 °C，混合液静置过夜，过滤后除去过量的浓硫酸，60 °C烘干。
[0048] 2、氧化石墨的制备
[0049] 烘干后的预氧化石墨加入到120mL浓硫酸中，在不断搅拌的情况下，缓慢加入15g 高锰酸钾，该过程在冰浴中进行，保证整个过程温度在80°C以下，持续搅拌2h。再次将反 应容器转移至冰浴环境中，加入去离子水，整个稀释过程中保证温度低于80°C，再持续搅拌 2h后加入700mL去离子水，之后滴加20mL，30wt %的双氧水，室温下搅拌lh，充分氧化石墨。
[0050] 3、超声剥离制得氧化石墨烯
[0051] 将上述所得的氧化石墨进行过滤，并将所得固体分散到稀盐酸溶液中（浓盐酸： 水（v/v) = 1 :9)，离心过滤后去除上清液，保留下层固体，此过程重复8次。之后，再用去 离子水去除固体中残留的盐酸，同样采用离心分离的方式，直至清洗液的pH值为7。最后 将上述滤饼再次溶解于少量去离子水中，于100W超声功率下超声lh，得到分散均匀的石墨 烯氧化物的悬浮液，经原子力显微镜检测，得到的氧化石墨烯尺寸分布在200-500nm，层数 1-2层，碳氧元素比为1. 9。
[0052] 4、氧化石墨烯粉末制备
[0053] 将上述氧化石墨烯转移至培养皿，置于烘箱中，50°C真空烘干，所得的氧化石墨烯 物理破碎，使用研钵研成粉末状，置于PE管中，4°C避光保存。
[0054] 实施例2
[0055] 本发明冷冻保存液的配制
[0056] 1、称取0. 5g葡萄糖、9g乳糖、0. 3g棉籽糖、1. lg 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、 1. 2gNaH2P04 · 2Η20、1· 6gNa2HP04 · 2Η20、1· 5g 氯化钠、3g 氯化钾、0· 02g 硫酸镁、0· 07g 氯化 钙、〇.6g酪蛋白，加入到1L去离子水中，充分混合溶解后，保存到37°C的恒温箱中，备用。为 以下实施例描述的方便，将这一步配制的冷冻保存液，简称为冷冻保存液A。
[0057] 2、含氧化石墨烯的冷冻保存液的配制
[0058] 称取一定量的实施例1制备的氧化石墨烯，超净间中物理破碎，在玛瑙研钵中研 磨成细末，100W超声30min，分散到第1步制备获得的冷冻保存液A中，使得氧化石墨烯的 质量百分比浓度为〇. 1 %，所得溶液pH值为7. 2。
[0059] 为以下实施例描述的方便，将这一步配制获得的含氧化石墨烯的冷冻保存液，简 称为冷冻保存液B。
[0060] 利用原子力显微镜测定分散液中的氧化石墨烯粒径范围在200~500nm左右，单 层的氧化石墨烯厚度在1. 5nm左右，具体见图1-3。
[0061] 实施例3
[0062] 不同样品对冰晶生长的抑制作用
[0063] 米用文献报道的方式（Deller R C, Vatish M, Mitchell D A, et al. Synthetic polymers enable non-vitreous cellular cryopreservation by reducing ice crystal growth during thawing[J]· Nature communications, 2014, 5.)评价不同样品在低温环境 中对冰晶生长的抑制作用。
[0064] 1、样品制备：选取0. 7%的生理盐水、本发明实施例2的冷冻保存液A(不含氧化 石墨烯）、20%甘油、商购氧化石墨烯水分散液（Sigma-Aldrich Co. LLC. 763713,其氧化石 墨稀的尺寸分布为200nm-12 μηι，2~3层，C/0为1. 9)和实施例1制备出的氧化石墨稀水分 散液（两种氧化石墨烯的水分散液浓度设定为质量百分比浓度〇. 01 %、〇. 1 %和〇. 5% )。同 时，对生理盐水、冷冻保存液A和20 %甘油还分别加入终质量百分比浓度为0. 01 %、0. 1 % 和0. 5%的实施例1制备的氧化石墨烯。
[0065] 2、将10 μ L样品转移到新鲜制备的云母表面，使其均匀分布在云母表面，利用冷 热台将云母快速降温至_60°C，再以5°C /min的速度升温至-6°C，在该温度下保持60min。
[0066] 3、利用显微镜对冰晶进行拍照，统计冰晶的大小，结果如下，表中的误差棒来源于 150个冰晶的统计结果：
[0067] 表1氧化石墨烯对不同液体体系冰晶生长的影响
[0069] 由表1可以看出，生理盐水、20%甘油和本发明的冷冻保存液A在未加入氧化石墨 烯之前，冰晶生长的尺寸均较大，加入微量的氧化石墨烯后冰晶的尺寸都有大幅减小，并且 随着氧化石墨烯加入量的增加，冰晶尺寸呈下降趋势，说明氧化石墨烯对液体冷冻和复苏 过程中的冰晶生长有抑制作用，且这种作用在各类液体体系中都存在，具有普适性。
[0070] 而本发明的冷冻保存液A在未加入氧化石墨烯情况下，冰晶的尺寸就和20%甘油 的冰晶尺寸接近，说明本发明的冷冻保存液本身就具备了常用抗冻剂的冷冻保护效果。在 加入氧化石墨烯之后，本发明的冷冻保存液A的冰晶尺寸减小的幅度最大，同样，随着氧化 石墨烯加入量的增加，冰晶尺寸持续大幅下降，最小可到100 μπι以下。说明本发明的冷冻 保存液与目前常用的生物培养或保存体系相比，非常适合与氧化石墨烯配合用在冷冻保存 技术中。
[0071] 此外，仅氧化石墨烯水分散液本身而言，不同来源的氧化石墨烯也都能抑制冰晶 的生长，并且对冰晶生长的抑制作用也与浓度相关。实施例1制备出的氧化石墨烯分散液 的抑制效果要略好于商购的氧化石墨烯分散液。与商购氧化石墨烯的比较可以得知，尺寸 分布在200~500nm范围内抑冰的效果会更好，这主要是由于尺寸过大时，在溶液中的片层 发生弯曲，不宜与冰晶结合。而尺寸过小时，表面上纯石墨烯的完整结构面积减小，不利于 吸附。因此更优选的氧化石墨稀尺寸在200