述的冷冻保存步骤进行 冷冻保存，时长为一个月。
[0114] 4.取出冷冻保存后的三七根细胞，进行恢复生长，控制培养温度在25°C，光照强 度为20001x，每天培养12h，培养15天。
[0115] 5.通过显微镜观察发现，在相同冷冻保存步骤和恢复培养条件下，加入氧化石墨 烯水分散液的三七根细胞增殖量和成活率明显高于空白样品。说明氧化石墨烯可用于植物 细胞的冷冻保存，能够提高植物细胞冷冻保存的效率。
[0116] 实施例9
[0117] 皮肤细胞组织低温保存
[0118] 1.在构筑好的直径为10cm的圆形皮肤细胞组织工程中转移至玻璃培养皿中，加 入20mL浓度均为20mmol/L的维生素 E和维生素 C，同时加入20mL氧化石墨烯的质量浓度 为0. 2%的氧化石墨烯水分散液，同时设计加入40mL浓度为10mmol/L的维生素 E和维生 素 C溶液作为空白对照。按照实施例4所述的步骤进行冷冻保存24h。冷冻保存结束后，在 37°C环境中复温18h后进行检测。
[0119] 2.添加有氧化石墨烯的低温冷冻保存液组在冷冻保存和复苏后，皮肤组织活力保 持在了较高的水平，通过加入染色剂与新鲜组织工程皮肤进行对比发现，虽然经过冷冻保 存和复苏的过程，组织工程皮肤的组织结构层次依然较为清晰，细胞数减少不明显，未出现 细胞皱缩和空腔，说明在低温情况下，低温保存液对组织工程皮肤的保存效果依然很好。组 织活力、细胞形态上都与新制的组织工程皮肤相似。说明氧化石墨烯也适于皮肤组织的冷 冻保存。
【主权项】
1. 氧化石墨烯用于抑制冷冻保存液冷冻和/或复苏过程中冰晶的生长。 优选所述的冷冻和/或复苏过程是生物材料的冷冻和/或复苏；进一步优选所述生物 材料选自细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物或植物的细胞、组织 或器官，以及通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞或组织；进一步优选所 述的生物材料选自人体、动物或植物的细胞、组织或器官以及通过生物工程技术获得的细 胞或组织；更优选为造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳 动物或人类的精子。2. 氧化石墨烯在制备冷冻保存液中的应用。 优选所述的冷冻保存液是用于生物材料的冷冻保存；进一步优选所述生物材料选自细 菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物或植物的细胞、组织或器官，以及 通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞或组织；进一步优选所述的生物材料 选自人体、动物或植物的细胞、组织或器官以及通过生物工程技术获得的细胞或组织；更优 选为造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的精 子。3. -种冷冻保存的方法，其特征在于，在冷冻保存液中添加氧化石墨烯。 优选所述的冷冻保存方法是生物材料的冷冻保存方法；进一步优选所述生物材料选自 细菌，真菌，病毒，藻类，立克次体，螺旋体，来源于人体、动物或植物的细胞、组织或器官，以 及通过生物工程技术获得的细菌、真菌、病毒、藻类、细胞或组织；进一步优选所述的生物材 料选自人体、动物或植物的细胞、组织或器官以及通过生物工程技术获得的细胞或组织；更 优选为造血干细胞，软骨组织，肾脏器官，三七的根细胞，皮肤工程组织，哺乳动物或人类的 精子。4. 权利要求1~3任一项所述的应用或方法，其特征在于，所述氧化石墨烯为片状，尺 寸为200nm-12 ym，优选为200~500nm ;层数为1~3层，优选为1~2层；碳氧元素比为 1. 5~2. 2:1，优选约为1. 9:1。 优选氧化石墨稀在冷冻保存液中的质量百分比浓度为〇. 001 %~2 %，优选为 0. 01% -1%，进一步优选为0. 05~0. 5%，更优选为0. 08~0. 3%，最优选约为0. 1%。5. 权利要求1~4任一项所述的应用或方法，其特征在于，所述冷冻保存液含有如下 组分：以每升水计，含有0. 3~0. 7g葡萄糖、7~IOg乳糖、0. 1~0. 5g棉籽糖、0. 9~I. 3g 4-轻乙基哌嗪乙磺酸、2~5g磷酸盐缓冲对、1~2g氯化钠、2~4g氯化钾、0. 01~0. 04g 硫酸镁、0.05~0? Ig氯化钙、0.5~Ig酪蛋白，pH值为6. 9~7. 5。 优选所述的磷酸盐缓冲对组成为：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠和磷酸三钠， 磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，磷酸氢二钾和磷酸三钾，或者磷酸氢二铵和磷酸二氢铵。最优选 为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，或者磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。 优选pH值为7. 1~7. 3。 优选，所述冷冻保存液含有如下组分：以每升水计，约〇. 5g葡萄糖、约9. Og乳糖、约 〇? 3g 棉籽糖、约 I. Ig 4-轻乙基哌嗪乙磺酸、约 I. 2g NaH2PO4 *21120、约 I. 6g Na2HPO4 *21120、 约I. 5g氯化钠、约3. Og氯化钾、约0. 02g硫酸镁、约0. 07g氯化钙、约0. 6g酪蛋白。6. 权利要求1~5任一项所述的应用或方法，其特征在于，冷冻步骤包括： (1)将生物材料加入到冷冻保存液中，转移至恒温箱，使得温度降至3~6°C，优选约为 5°C，在该温度下维持60~120分钟，优选约90分钟；和 (2)采用程序控温的方式使得保存液体系温度以20~60°C /min的速度降至 约-140°C，将降温后的保存液体系置于液氮罐中进行保存；优选以约40°C/min的速度降至 约-110°C，再以约 20°C /min 降至约-140°C。7. -种冷冻保存液，其特征在于，含有氧化石墨烯，所述氧化石墨烯为片状，尺寸为 200nm_12 y m，优选为200~500nm ;层数为1~3层，优选为1~2层；碳氧元素比为L 5~ 2. 2:1，优选约为1.9:1。 优选氧化石墨稀在冷冻保存液中的质量百分比浓度为〇. 001 %~2 %，优选为 0. 01% -1%，进一步优选为0. 05~0. 5%，更优选为0. 08~0. 3%，最优选约为0. 1%。8. 权利要求7所述的冷冻保存液，其特征在于，进一步含有如下组分：以每升水计，含 有0. 3~0. 7g葡萄糖、7~IOg乳糖、0. 1~0. 5g棉籽糖、0. 9~I. 3g 4-轻乙基哌嗪乙 磺酸、2~5g磷酸盐缓冲对、1~2g氯化钠、2~4g氯化钾、0. 01~0. 04g硫酸镁、0. 05~ 〇? Ig氯化钙、0.5~Ig酪蛋白，pH值为6. 9~7. 5。 优选所述的磷酸盐缓冲对组成为：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠和磷酸三钠， 磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，磷酸氢二钾和磷酸三钾，或者磷酸氢二铵和磷酸二氢铵。最优选 为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，或者磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。 优选冷冻保存液的pH值为7. 1~7. 3。 优选，所述冷冻保存液含有如下组分：以每升水计，约〇. 5g葡萄糖、约9. Og乳糖、约 〇? 3g 棉籽糖、约 I. Ig 4-轻乙基哌嗪乙磺酸、约 I. 2g NaH2PO4 *21120、约 I. 6g Na2HPO4 *21120、 约I. 5g氯化钠、约3. Og氯化钾、约0. 02g硫酸镁、约0. 07g氯化钙、约0. 6g酪蛋白。9. 一种冷冻保存液，其含有如下组分：以每升水计，含有0. 3~0. 7g葡萄糖、7~IOg 乳糖、〇. 1~〇. 5g棉籽糖、0. 9~I. 3g 4-轻乙基哌嗪乙磺酸、2~5g磷酸盐缓冲对、1~2g 氯化钠、2~4g氯化钾、0.01~0.04g硫酸镁、0.05~0? Ig氯化钙、0.5~Ig酪蛋白，pH值 为 6. 9 ~7. 5。 优选所述的磷酸盐缓冲对组成为：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠和磷酸三钠， 磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，磷酸氢二钾和磷酸三钾，或者磷酸氢二铵和磷酸二氢铵。最优选 为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，或者磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。 优选冷冻保存液的pH值为7. 1~7. 3。 优选，所述冷冻保存液含有如下组分：以每升水计，约〇. 5g葡萄糖、约9. Og乳糖、约 〇? 3g 棉籽糖、约 I. Ig 4-轻乙基哌嗪乙磺酸、约 I. 2g NaH2PO4 *21120、约 I. 6g Na2HPO4 *21120、 约I. 5g氯化钠、约3. Og氯化钾、约0. 02g硫酸镁、约0. 07g氯化钙、约0. 6g酪蛋白。 优选进一步含有甘油、DMSO和/或氧化石墨烯。10. 权利要求9所述的冷冻保存液，所述氧化石墨烯为片状，尺寸为200nm-12 y m，优选 为200~500nm ;层数为1~3层，优选为1~2层；碳氧元素比为1. 5~2. 2:1，优选约为 1. 9:1〇 优选，所选氧化石墨烯在冷冻保存液中的质量百分比浓度为〇. 001 %~2%，优选为 0. 01 %~1 %，进一步优选为0. 05~0. 5 %，更优选为0. 08~0. 3 %，最优选约为0. 1 %。
【专利摘要】本发明提供了一种含有二维材料—氧化石墨烯的冷冻保存液，其制备及应用，属于生物材料冷冻保存技术领域。在冷冻保存液中，通过添加氧化石墨烯，能够抑制冷冻保存液复苏过程中微小冰晶的生长，进而避免了冰晶生长过程对细胞的破坏作用，从而大大提高了生物材料冷冻保存复苏后的存活率和细胞活动性。由于该方法着眼于抑制冰晶生长，因此这种冷冻保存液具有较高的普适性，可以用于细胞、组织等的冷冻保存，最大限度地满足了现实使用的需要。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105230610
【申请号】CN201510781783
【发明人】耿洪亚, 刘凯, 王建君, 吕建勇
【申请人】中国科学院化学研究所
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月13日