利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法

文档序号:9494252阅读:286来源:国知局
利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法
【技术领域】:
[0001] 本发明涉及利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种鉴 定方法及其在农业上的应用,属于农业科学技术领域。
【背景技术】:
[0002] 水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus,RBSDV)属于呼肠孤病毒 科斐济病毒属第二组成员,以灰飞虱为主要传毒媒介进行持久性传播,介体灰飞虱一旦染 毒,终身带毒,并能连续传毒,但不经卵传毒。自然条件下,主要寄主有水稻、玉米、大麦、小 麦、高粱、粟、看麦娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物,其中以玉米人工接种最为敏感。在我 国,RBSDV侵染小麦引起小麦绿矮病,侵染玉米引起玉米粗缩病,侵染水稻引起水稻黑条矮 缩病。小麦绿矮病植株的典型症状为植株矮缩、叶色浓绿,分蘖略有增多,心叶有缺刻;玉米 粗缩病植株的典型症状为植株矮缩,叶色浓绿,叶片僵直、宽短而厚,叶背面出现蜡白色短 条状突起,后期突起变褐色,籽粒较少或不结籽粒。上世纪60年代以来,玉米粗缩病在我国 各玉米产区均有不同程度发生,多次暴发流行,对我国玉米生产构成严重威胁。
[0003] 选用抗病品种防治玉米粗缩病是最经济有效的措施。由于RBSDV等由昆虫作为媒 介的特殊传播方式,不能使用病汁液摩擦进行直接接种。研究者主要采用田间自然传毒鉴 定和人工接种鉴定进行玉米粗缩病的品种抗性鉴定。田间鉴定易受环境条件、灰飞虱种群 发生及迀飞数量等因素的影响,鉴定的准确性较差,使选育抗病品种往往需多年多地重复 鉴定,极大延缓了抗玉米粗缩病育种进程。人工接种鉴定提高了玉米粗缩病品种抗性鉴定 的准确性,目前成熟的方法是通过在玉米病株上饲喂获得携带RBSDV的灰飞虱进行病毒接 种,这就需等当年玉米发病后才能开展鉴定工作,极大限制了研究时间,此外灰飞虱不能在 玉米上繁殖,以玉米病株为毒源会影响灰飞虱的带毒率。利用小麦绿矮病植株为毒源开展 玉米粗缩病的品种抗性接种鉴定工作,提高了灰飞虱带毒率,延长了接种时间,从而拓宽了 玉米品种抗性鉴定时间,以期为玉米品种的抗性评价、抗玉米粗缩病品种的选育等提供切 实可行的鉴定技术,加快抗玉米粗缩病的育种进程。

【发明内容】

[0004] 本发明提供了利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种 鉴定方法。
[0005] 本发明的原理是:小麦拔节期,田间采集表现小麦绿矮病典型症状的小麦植株,分 子检测方法确定为小麦绿矮病植株,利用小麦绿矮病植株为毒源进行玉米品种对玉米粗缩 病抗性接种鉴定。
[0006] 在上述方法中,小麦绿矮病典型症状是指植株矮缩、叶色浓绿,分蘖略有增多,心 叶有缺刻。
[0007] 本发明提供了一种利用小麦绿矮病植株为毒源的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定 方法,利用该方法评价玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平,既拓宽了品种抗性鉴定时间,又 提高了灰飞虱的带毒率。这一鉴定方法可以应用于玉米品种资源的发掘鉴定、品种抗性评 价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
【附图说明】:
[0008] 图1小麦绿矮病植株与健康小麦植株不意图
[0009] 图2疑似小麦绿矮病植株RT-PCR检测结果(M:MarkerIII;1-17 :疑似小麦绿矮 病植株;CK+:阳性对照;CK:阴性对照)
[0010] 图3小麦绿矮病植株为毒源饲喂灰飞虱示意图
[0011] 图4携带RBSDV的灰飞虱接种玉米幼苗示意图
[0012] 图5玉米粗缩病植株为毒源饲喂灰飞虱示意图
[0013] 图6利用不同毒源饲喂灰飞虱所得灰飞虱带毒率(A:小麦绿矮病植株为毒源;B: 玉米粗缩病植株为毒源)
【具体实施方式】:
[0014] 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0015] 实施例1,利用小麦绿矮植株为毒源建立的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法
[0016] (1)携带RBSDV新鲜小麦植株的获得
[0017] 2013年4月于江苏建湖重病区采集植株矮缩、叶色浓绿,分蘖略有增多,心叶有缺 刻等表现出小麦绿矮病典型症状的新鲜小麦植株(图1)。参照Trizol(Reagent)说明书提 取小麦叶片的总RNA。采用已发表引物RB1-S9-F:5' -GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3 ^(R: A/G;Y:T/C;M:A/C)和RB-S9-R:5 ' -GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3 '(H:T/G;M:G/A/ T)(引物由上海生工生物技术公司合成)进行RT-PCR检测,确定小麦疑似病株是否携带 RBSDV。以提取的2μL小麦叶片总RNA为模板、RB-S9-R为引物,参照M-MuLV反转录酶 (Fermentas)说明书进行反转录,合成cDNA。以合成的2μLcDNA为模板、RB1-S9-F/RB-S9-R 为引物进行PCR反应,使用常规PCR反应体系,最终体系由ddH20补足25μL。PCR反应程 序为94°(:预变性5!1^11;94°(:变性458,53°(:退火458,72°(:延伸9〇8,35个循环 ;72°(:延伸 lOmin。反应结束后取2μLPCR扩增产物于1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带 (1200bp)(图2)。同时采用斑点免疫结合法(Dot-ELISA)确定病株不携带水稻条纹病毒 (RSV)。挑选出3株仅含有RBSDV的小麦植株饲毒。
[0018] (2)小麦绿矮病植株为毒源饲喂灰飞虱
[0019] 本室常年饲养无毒灰飞虱群体,为避免传毒介体污染,每次使用无毒灰飞虱若虫 前取100头Dot-ELISA法检测其是否携带RSV,确定其为无毒虫。将筛选得到的新鲜小麦病 株种于1000mL烧杯中,土面覆盖滤纸,将适量1-2龄无毒灰飞虱若虫移入其中,并用纱布封 口(图3),饲喂48h后将其移入预先育有武育粳3号健康秧苗的1000mL烧杯中过循回期 (10-12d),循回期过后取100头灰飞虱Dot-ELISA法检测其RBSDV带毒率。
[0020] (3)玉米粗缩病品种抗性鉴定
[0021] 将感病玉米品种苏951播于塑料杯中,每杯播种5株苗,待玉米苗长至2叶龄时进 行接种鉴定(接种前2d淘汰病弱苗,挑选生长一致的幼苗4株用于接种鉴定),重复3次, 每个重复20株(图4)。根据(2)中测定的灰飞虱带毒率换算有效接种虫量(有效接种虫 量=接种虫量X带毒率),本实验中有效接种虫量为3头/株。接入灰飞虱后每天赶虫2 次以确保被测水稻均匀获毒,接种48h后移走灰飞虱,4叶时将玉米移栽至室外,正常水肥 管理。30d后开始病害调查,每2天调查一次,连续调查3次。玉米粗缩病植株症状主要表 现为植株矮化,叶色浓绿,叶片僵直、宽短而厚,心叶不能正常展开,叶片背部叶脉上产生蜡 白色隆起条纹,用手触摸有明显粗糙感。
[0022] 实施例2,分别以小麦绿矮病植株和玉米粗缩病植株为毒源的比较研究
[0023] (1)灰飞虱带毒率的比较
[0024] 参照实施例1中(2),分别利用小麦绿矮病植株与玉米粗缩病植株为毒源饲喂1-2 龄灰飞虱(图5),度过循回期后分别取100头灰飞虱Dot-ELISA法检测两种毒源所饲喂灰 飞虱的带毒率。结果显示,利用小麦绿矮病植株为毒源饲喂的灰飞虱带毒率为35% (图 6A),而利用玉米粗缩病植株为毒源饲喂的灰飞虱带毒率为13% (图6B)。
[0025] (2)玉米发病率的比较
[0026] 参照实施例1中的(3),分别利用以小麦绿矮病植株与玉米粗缩病植株为毒源饲 喂的灰飞虱接种玉米(有效接种虫量都为3头/株),比较玉米发病率,无毒灰飞虱接种作 为对照。由表1可见,两种毒源饲喂灰飞虱所接种玉米的发病率均为100%。
[0027] 表1玉米发病率
[0028]
[0029] 上述实施不以任何形式限定本发明。
【主权项】
1. 一种利用小麦绿矮病植株为毒源的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法,其特征在 于:于小麦拔节期田间采集表现出植株矮缩、叶色浓绿,分蘖略有增多,心叶有缺刻典型症 状的小麦植株,以利用分子检测方法确定为小麦绿矮病的植株为毒源进行玉米品种对玉米 粗缩病的抗性接种鉴定。
【专利摘要】本发明提供了一种利用小麦绿矮病植株为毒源建立的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法。本发明的原理是于小麦拔节期田间采集表现小麦绿矮病典型症状的小麦植株,分子检测方法确定为小麦绿矮病植株,利用小麦绿矮病植株为毒源进行玉米品种对玉米粗缩病抗性接种鉴定。利用该方法评价玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平,既拓宽了品种抗性鉴定时间,又提高了灰飞虱的带毒率。这一鉴定方法可以应用于玉米品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
【IPC分类】A01G7/00
【公开号】CN105248168
【申请号】CN201510716669
【发明人】周彤, 杜琳琳, 周益军, 吕建颖, 曹晓燕, 兰莹, 孙枫
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月26日
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