一种印楝愈伤组织诱导不定根的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物的不定根组织培养及生产方法，特别是涉及一种印楝愈伤组 织不定根的诱导方法。
【背景技术】
[0002] 印楝属于楝科楝属，主要分布在印巴次大陆干旱地区的一种热带植物，可作为重 要的植物源农药树种。从印楝中提取到的活性成分具有抑菌杀毒、抗肿瘤、抗癌、避孕、抗衰 老等特性，被广泛应用于医药、农药、化妆品以及生态环境改良等多种领域。印楝素是其主 要活性物质，存在于根、茎、叶和种子等各个部位，种子中含量最高，以其为主要成分制成的 农药是目前药效最高，效果最好的产品，具有人畜无害、无污染、不易产生抗药性等特点。但 是，印楝种子为一年生且产籽低，不同地区不同树的种子中印楝素含量不同，收集过程中损 失较大，化学合成也不经济，不能够满足工农业日益增长的需求。
[0003] 近年来，用农杆菌感染印楝外植体产生的发根生长迅速，其印楝素的含量比自然 生长的印楝种子中高出很多倍，且在诱导的过程中涉及到外源基因的插入，在使用的过程 中对于害虫的抗药性存在一定的风险。
[0004] 目前，关于印楝愈伤组织诱导不定根的文献报道极少，因此，有必要提供一种简单 新型的印楝愈伤诱导不定根的培养方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用印楝愈伤组织诱导不定根的方法。
[0006] 本发明的技术方案概括如下：
[0007] -种印楝愈伤组织诱导不定根的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)印楝愈伤组织的诱导：采集印楝叶灭菌后，切成小片段接种于固体培养基上， 在无菌、温度为25-27Γ及黑暗条件下培养3-5周，得到愈伤组织，并继代培养3-5次；
[0009] (2)印楝不定根的诱导：将愈伤组织接种到印楝不定根诱导培养基中培养，在无 菌、温度为25-27Γ、黑暗条件下培养3-5周，得到印楝不定根。
[0010]印楝愈伤诱导固体培养基为在MS培养基中加入吲哚丁酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和 琼脂，使吲哚乙酸的终浓度为2-3mg/L、6-苄氨基嘌呤的终浓度为l-2mg/L、蔗糖终浓度为 30-40g/L、琼脂终浓度为 6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。
[0011] 印楝愈伤不定根诱导固体培养基为在MS培养基中加入萘乙酸、蔗糖和琼脂， 使萘乙酸终浓度为0. 05-0. 3mg/L、蔗糖终浓度为30-40g/L琼脂终浓度为6-7g/L，pH = 5. 8~6. 0〇
[0012] 本发明的优点：
[0013] 本发明利用组织培养方法培养印楝愈伤诱导不定根，其生长速度比自然生长较 快，培养物较均一，且比农杆菌浸染印楝外植体产生发根诱导率高，不受外界地域条件的限 制，工艺简单，成本低廉，重复性好。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0015] 不定根诱导率=(愈伤组织不定根生根数/总接种愈伤组织数）X 100%。
[0016] 实施例1
[0017] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入吲哚丁酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和琼脂，使 吲哚乙酸的终浓度为2mg/L，6-苄氨基嘌呤的终浓度为lmg/L，蔗糖终浓度为40g/L，琼脂终 浓度为6g/L，调pH = 5.8,在121°C，0.1 Mpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
[0018] 实施例2
[0019] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入吲哚丁酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和琼脂，使 吲哚乙酸的终浓度为3mg/L，6-苄氨基嘌呤的终浓度为lmg/L，蔗糖终浓度为30g/L，琼脂终 浓度为7g/L，调pH = 5.9,在121°C，0.1 Mpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
[0020] 实施例3
[0021 ] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入吲哚丁酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和琼脂，使 吲哚乙酸的终浓度为2mg/L，6-苄氨基嘌呤的终浓度为2mg/L，蔗糖终浓度为35g/L，琼脂终 浓度为7g/L，调pH = 6.0,在121°C，0.1 Mpa压力的条件下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
[0022] 实施例4
[0023] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入萘乙酸、蔗糖和琼脂，使萘乙酸的终浓度 为0. 3mg/L，蔗糖终浓度为40g/L，琼脂终浓度为6g/L，调pH = 5. 8,在121°C，0.1 Mpa压力 的条件下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
[0024] 实施例5
[0025] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入萘乙酸、蔗糖和琼脂，使萘乙酸的终浓度 为0· 05mg/L，蔗糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为7g/L，调pH = 5. 9,在121°C，0· IMpa压力 的条件下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
[0026] 实施例6
[0027] 固体培养基的制备：在MS培养基中加入萘乙酸、蔗糖和琼脂，使萘乙酸的终浓度 为0· 2mg/L，蔗糖终浓度为35g/L，琼脂终浓度为7g/L，调pH = 6. 0,在121°C，0· IMpa压力 的条件下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
[0028] MS培养基配方见表1
[0029] 表1MS培养基配方表
[0030]
[0031] 实施例7
[0032] 一种印楝愈伤组织不定根诱导的方法，包括以下步骤：
[0033] (1)印楝愈伤组织的诱导：采集印楝叶灭菌后，切成小片段接种于实施例1的固体 培养基上，在无菌、黑暗及25°C的条件下培养4周后，得到愈伤组织，并继代3-4次。
[0034] (2)印楝愈伤组织不定根的诱导：将愈伤组织接种到实施例4的固体培养基上，在 无菌、黑暗及25 °C的条件下培养4周，得到不定根。
[0035] 实施例8
[0036] 本发明获得的印楝愈伤组织诱导的不定根的诱导率实施例4到实施例6分别为： 33. 4%、13. 3%、20. 0%。平均每块愈伤组织的不定根数差异采用T检验，p < 0. 01。
【主权项】
1. 一种印楝愈伤组织诱导不定根的方法，其特征在于包括以下步骤： 首先，印楝愈伤组织的诱导：将灭菌过的印楝叶作为外植体切成0. 5X0. 5cm2的片段后 接种到愈伤组织诱导培养基中培养，在无菌、温度为25-27Γ、避光条件下培养3-5周，得到 愈伤组织，并继代培养3-5次；其次，印楝不定根的诱导：将愈伤组织接种到印楝不定根诱 导培养基中培养，在无菌、温度为25-27°C、避光条件下培养3-5周，得到印楝不定根。2. 根据权利要求1所述的一种印楝愈伤组织不定根的诱导及组织培养方法，其特征在 于，所述第一步，所述的印楝愈伤组织培养基为在1L的MS培养基中加入吲哚丁酸、6-苄氨 基嘌呤、蔗糖和琼脂，使吲哚丁酸的终浓度为2-3mg/L、6-苄氨基嘌呤的终浓度为l-2mg/L、 蔗糖终浓度为30-40g/L、琼脂终浓度为6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。3. 根据权利要求1所述的印楝愈伤诱导不定根的方法，其特征在于，所述第二步，所述 的愈伤组织生根诱导培养基为1LMS培养基中含有萘乙酸，蔗糖和琼脂，使萘乙酸的终浓度 为 0· 05-0. 3mg/L、蔗糖终浓度为 30-40g/L、琼脂终浓度为 6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。
【专利摘要】一种印楝愈伤组织诱导不定根的方法，属于生物工程领域。本发明利用了植物细胞的全能性和植物组织培养技术，将灭菌后的印楝叶作为外植体切成0.5×0.5cm2的片段，置于诱导愈伤组织的培养基中，在适宜的条件下培养，使其脱分化形成愈伤组织，从而在愈伤组织诱导不定根培养基中培养，3-5周天后诱导出不定根，诱导率较高。本发明过程简单，能在短期内快速有效地将印楝叶诱导出愈伤组织，并将此愈伤组织诱导出不定根，工艺简单，成本低廉，同时为印楝植物中活性物质印楝素的制备提供新的技术方案。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105284611
【申请号】CN201510631153
【发明人】李兴林, 汪珊英, 别振宇
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月25日