一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法。
【背景技术】
[0002] 果实成熟期在育种上是一项重要的经济性状。我国南方地区6月份进入梅雨季 节，这个时期成熟的桃子受天气影响，大多品质不好，并且雨季影响市民对桃的购买能力， 使得早熟桃在上海地区的发展受到制约，但是上海地区5月底到6月上旬天气晴朗，雨水 少，如果能把早熟桃成熟期提前到这个时间，将会丰富我国桃品种资源、增加桃果品市场供 应，促进南方地区桃产业的发展。
[0003] 桃成熟早、品质好，栽培管理省工，亩产值收入高，因而创造特早熟类型更有重要 意义，也是近代各国果树育种学家向往和追求的目标之一。但当人们旨在创造特早熟新品 种时，却常常会遇到杂种种胚不育的问题，阻碍着育种工作的进展。
[0004] 激素含量的异常会导致种子败育。陈伟2000年研究荔枝败育品种开始出现败育 时IAA、GA1+3、CTK含量急剧下降，可能是生长促进物质含量的不足影响胚的细胞分裂与生 物大分子的合成，造成生理代谢的紊乱及物质和能量亏损，使胚不能正常发育，最终导致败 育。黄碧光等（1997)年在蕉柑幼果发育过程中也发现了这种现象。
[0005] 胚培养在桃遗传育种中的应用最早开始于1933年，Tukey首先进行了果实生长快 慢与桃胚大小关系的研究，并开展了桃胚的培养。20世纪40年代起胚培养技术开始广泛 应用于果树育种。近些年来，通过桃胚培养技术已经选育出了许多优良品种，特别是早熟品 种。如春蕾、春花、早花露、早霞露、玫瑰露、Mayfire、Golderest、华光、艳光等。
[0006] 但是，在胚挽救过程中，品种基因型、取样接种时间、培养基种类与相态、植物生长 调节剂、碳源、培养环境、移栽方式等都会对胚挽救的萌发率和成苗率产生影响，且各因子 相互作用，特早熟桃由于种胚很小，并且发育过程中出现败育现象，其胚培过程需要先让胚 长大然后再萌发成苗，操作复杂，成苗率低，严重限制了特早熟桃的育种效率。
[0007] 因此，很有必要深入开展特早熟桃的胚挽救技术研究，以提高特早熟桃胚挽救育 种的成苗率。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法，有效地促进特早熟 桃杂交胚发育，在离体组织培养条件下能发育成苗，且萌发后的试管苗健壮整齐，提高特早 熟桃中胚挽救育种效率。
[0009] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010] -种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)取样接种
[0012] 在特早熟桃品种杂交授粉后，摘取七到八分熟果实，对果实消毒，破核取出胚珠， 将胚珠接种在生长培养基中；所述的生长培养基中包含SH培养基、植物生长调节剂、蔗糖 和活性炭；
[0013] 2)胚珠培养
[0014] 将步骤1)中接种至生长培养基中的胚珠进行暗培养，暗培养的温度为20~28°C， 培养20~40天，得到膨大的胚珠；
[0015] 3)幼胚分化培养
[0016] 将步骤2)中膨大的胚珠剥去种皮，得到幼胚，将长度大于1mm的幼胚转接到分化 培养基中，于2~7°C低温暗培养70~90天，得到打破休眠的胚；
[0017] 4)胚萌发培养
[0018] 将打破休眠的胚进行光照培养，培养温度18~23°C，培养7~15天后得到试管 苗；
[0019] 5)移苗
[0020] 将具有3~6片真叶、5条以上须根的试管苗移栽到基质中，移到温室中进行常规 管理，得到幼苗，在终霜期后将幼苗移栽到大田中。
[0021] 进一步，步骤1)中对果实消毒的方法为：先用体积分数为70~85%酒精浸没果 实，消毒10~2011^11，然后用20~30%次氯酸钠浸没果实，消毒10~201^11。
[0022] 优选地，步骤1)中所述的生长培养基中的植物生长调节剂为吲哚乙酸和赤霉素。
[0023] 又进一步，步骤1)中所述的生长培养基包含SH培养基、吲哚乙酸1~2. 5mg/L、赤 霉素0· 5~1. 5mg/L、鹿糖55~65g/L和活性炭0· 5~2. 5g/L。
[0024] 优选地，步骤2)胚珠培养中暗培养温度为22~26 °C，培养25~35天。
[0025] 进一步，步骤3)中的低温暗培养温度为4~5°C，所述分化培养基为木本培养基。
[0026] 进一步，步骤5)中移栽入基质的试管苗具有5~6片真叶，5条以上须根，基质为 进口草炭：珍珠岩=1 :1~3,体积比，将试管苗移栽到基质中后罩住保湿，3天后打开透 气。
[0027] 本发明的SH (Stewart and Hsu)培养基的pH为5. 8,成分见表1 :
[0028] 表 1
[0030] 本发明的木本培养基（Woody Plant medium，简称WPM培养基）的pH为5. 8,其成 分见表2 :
[0031] 表 2
[0033] 本发明在特早熟桃品种杂交授粉后，采取七到八分熟的果实，采取时间适宜，若采 样太早，则胚的生长力低，采样太晚时果实变软，不容易取核也容易发生污染。在接种时要 严禁使用腐烂的果实，在移栽后的管理中立枯病与褐腐病是危害成活的主要病害，要早起 发现与防治。
[0034] 植物激素是代谢反应的产物，同时又在基因，蛋白质（酶）和细胞膜等各种水平上 调节植物的生命活动。研究表明，胚的大小和形态受胚乳调控基因的影响，即胚乳特异基因 通过调控胚乳发育影响胚的发育。Kinoshita等（1999)的研究也发现，胚乳中Mea基因的 突变会导致胚乳败育，进而导致胚中途败育。对体细胞胚进行研究发现，激素通过调节控制 胚胎发育相关基因的开启和关闭而影响胚胎的发育。
[0035] 研究表明，胚乳败育在先，胚随后发生败育，胚的发育是依赖胚乳提供养料，因此， 胚乳的退化会导致胚的中途败育。胚和胚乳的生理活性物质代谢失调，使胚乳不能从珠心 得到营养，胚乳不能正常发育，同时，胚不能释放出分解酶溶解胚乳，使胚无法从胚乳中吸 收养分，或根本就没有胚乳可供营养吸收，使胚在饥饿中夭亡。
[0036] 合子胚的发育是在胚珠中进行的，胚珠中的生长促进物质促进了胚胎的细胞分裂 和生长、核酸和蛋白质的合成以及光合产物的输入和积累，这对胚胎的正常发育无疑是至 关重要，胚珠中生长促进物质亏损可能影响胚胎的细胞分裂和分化，生物大分子的合成和 营养物质的输入，从而阻碍了胚胎的正常发育，导致胚败育的发生，因此，胚珠中生长抑制 物质和生长促进物质的平衡失调是导致胚败育的重要原因。
[0037] 吲哚乙酸（IAA)与赤霉素（GA3)为生长促进物质，脱落酸（ΑΒΑ)为生长抑制物质， 易败育和不易败育品种的（IAA+GA3)/ΑΒΑ比值存在显著差异，在胚珠败育的关键期，易败 育品种的ΙΑΑ和GA3含量比不败育品种的含量低，（IAA+GA3)/ABA比值低，在胚胎发育期， IAA与GA3含量亏缺将会导致胚胎发育停止。
[0038] 本发明特早熟桃的胚珠培养过程中，添加了外源性生长促进物质一吲哚乙酸与赤 霉素，促进了胚珠对营养物质的吸收，维持了胚性生长，促进了幼胚的生长。本发明添加的 吲哚乙酸和赤霉素都能使细胞伸长生长，吲哚乙酸可以直接影响细胞的伸长、分裂和分化， 赤霉素可以促进吲哚乙酸的合成，通过促使合成生长素来实现促使细胞生长的目的，避免 胚败育的发生。
[0039] 同时，本发明的生长培养基中添加了蔗糖，幼胚的生长需要较高浓度的蔗糖，提供 能量的同时，提高了渗透压，在这种较高的渗透压下胚珠才能够长大，另外，本发明添加的 活性炭有利于吸收胚生长过程中的有害物质。
[0040] 本发明采用了较低的胚萌发的培养温度18~23°C，与自然生长条件下桃种子萌 发的环境温度相接近，在较低的培养温度条件下，获得的幼苗的株高得到提升，萌发率比常 规的培养温度为28~30°C的条件下提高13~22%，在温室移栽后存活率提高了 16%，并 且，培养温度较高时萌发的幼苗会出现顶部坏死的现象，而本发明的培养条件下避免了幼 苗出现顶部坏死的现象。
[0041] 本发明在胚珠培养过程中，使用的分化培养基能够使胚的生长力（即胚珠在生长 培养基上培养后长度大于1毫米的幼胚数目X 100% /接种胚珠数）达到83. 3 %，而常规 培养则为55% ;长大的胚中正常胚率（即正常胚/所有长度大于1mm的胚数）提高，所述 的正常胚为在生长培养基培养结束后具有两瓣规则子叶的胚，本发明长大的胚中有88%的 正常胚，而常规培养仅有12%的正常胚；分化力（即胚在分化培养基上的成苗数X 100% / 大