一种硬叶兰组织培养繁育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种硬叶兰组织培养繁育方法。
【背景技术】
[0002]硬叶兰(Cymbidium bicolor Lindl.)为兰科药用植物，全草入药，具有散瘀止血、清热润肺、化痰止咳等功效。此外，硬叶兰还极具观赏价值。但硬叶兰的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，本身无法储存养分，自然条件下，其种子萌发阶段完全依靠菌根真菌为其提供养分，自然繁殖率低，时间长。因此，野生硬叶兰非常稀少，由于长期过度采掘及生态环境的破坏，硬叶兰已处于濒危状态，种子种苗稀缺，资源更新非常困难。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种硬叶兰组织培养繁育方法，能够快速有效地提高硬叶兰种苗的繁殖速度和质量，实现硬叶兰优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
[0004]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种硬叶兰组织培养繁育方法，包括以下步骤:
[0005](1)外植体的选择与消毒:取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1?八％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
[0006](2)初代诱导获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001UX，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、4.0mg/L 的 ΝΑΑ、2.0mg/L 的 PVP、30g/L 蔗糖和 5g/L 的琼脂，培养基的 pH 值为 5.8 ；
[0007](3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加2.0-5.0mg/L的6_BA、0.2-0.6mg/LNAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0008]本发明的突出优点在于:
[0009](1)采用生物技术对硬叶兰进行组织培养快速繁殖，能够在短时间内培育出大量适合栽培种植的硬叶兰幼苗，保障硬叶兰种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
[0010](2)采用本发明所述的培养方法得到的硬叶兰丛生芽增殖系数达到20-30倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0012]实施例1
[0013]本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的一个实例，包括以下步骤:
[0014](1)外植体的选择与消毒:取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1?八％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
[0015](2)初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001UX，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加 0.3mg/L 的 6-BA、4.0mg/L 的 ΝΑΑ、2.0mg/L 的 PVP、30g/L 蔗糖和 5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0016](3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽。其中，1/3MS繁殖培养基中添加2.0mg/L的6_BA、0.3mg/L的NAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为21.6。
[0017]实施例2
[0018]本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的又一个实例，包括以下步骤:
[0019](1)外植体的选择与消毒:取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1?八％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
[0020](2)初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23_27°C，光照强度15001UX，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加 0.3mg/L 的 6-BA、4.0mg/L 的 ΝΑΑ、2.0mg/L 的 PVP、30g/L 蔗糖和 5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0021](3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加3.0mg/L的6_BA、0.4mg/L的NAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为24.8。
[0022]实施例3
[0023]本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的再一个实例，包括以下步骤:
[0024](1)外植体的选择与消毒:取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1?八％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
[0025](2)初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间8-10小时/天的条件下，培养60天，得到无菌试管苗。其中，MS诱导培养基中添加 0.3mg/L 的 6-BA、4.0mg/L 的 NAA、2.0mg/L 的 PVP、30g/L 蔗糖和 5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0026](3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加3.0mg/L的6_BA、0.5mg/L的NAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为30.2。
[0027]实施例4
[0028]本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的又一个实例，包括以下步骤:
[0029](1)外植体的选择与消毒:取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v%洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15_30min，添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1￥八％升汞消毒8-10min，无菌水冲洗3_5次，最后，用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体。其中，无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
[0030](2)初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间8-10小时/天的条件下，培养60天，得到无菌试管苗。其中，MS诱导培养基中添加 0.3mg/L 的 6-BA、4.0mg/L 的 NAA、2.0mg/L 的 PVP、30g/L 蔗糖和 5g/L 的琼脂，培养基的pH值为5.8 ;
[0031](3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽。其中，1/3MS繁殖培养基中添加了 5.0mg/L的6_BA、0.6mg/L的NAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为23.5。
【主权项】
1.一种硬叶兰组织培养繁育方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)外植体的选择与消毒:取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15_30min、添加了 2_3滴吐温-20的100毫升0.1?八％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水； (2)初代诱导获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001UX，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、.4.0mg/L的NAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8 ; (3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加2.0-5.0mg/L的6_BA、0.2-0.6mg/LNAA、2.0mg/L的PVP、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
【专利摘要】一种硬叶兰组织培养繁育方法，包括如下步骤：(1)取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽。采用本发明所述的培养方法得到的硬叶兰丛生芽增殖系数达到20-30倍，能够在短时间内提供健壮的硬叶兰优质种苗，有效解决硬叶兰规模化育苗的问题。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105284623
【申请号】CN201510781057
【发明人】王晓峰, 李刚, 缪剑华, 韦坤华, 李翠, 李林轩, 王一诺
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月13日