抗除草剂大麦的制作方法_3

文档序号:9529953阅读:来源:国知局
0088] a.概述:
[0089] 检测按照在先的实施例就抗除草剂咪唑啉酮筛选并鉴定为含有抗性决定因素的 大麦(Hordeum vulgare L)突变株系,以确认并表征突变株系,乙酰轻酸合酶(AHAS)基因 的疑似突变等位基因,并重测序来鉴定DNA碱基改变。核对所述DNA序列,并将其与野生型 序列和已知突变体作比较。
[0090] b.实验方法和结果:
[0091] 植物材料由野生型基因型、Buloke和Buloke衍生的编号为VBHT0802 (NCMB 41547)、VBHT0805 (NCHMB 41549)、VBHT0806 (NCHMB 41550)和 VBHT0810 (未保藏)的 4 个 突变株系组成。从Genbank集合AHAS基因的公开参考序列。所述序列是从一系列单子叶 植物种(包括大麦)中获得的,用于在所述基因保守区域设计PCR引物来确保引物起到最 佳作用。总共设计了 20个正向和反向引物以使能最大覆盖可获得的基因序列,提供多种引 物配对选择以降低引物不良表现的可能性。
[0092] 对提供的全部DNA模板进行使用标准条件的PCR扩增检测。用所有可能的引物组 合进行的扩增结果不佳,并且导致产生多种产物,这通过在琼脂糖凝胶上解析得知。使用嵌 套PCR来降低扩增产物的复杂性并增加反应的特异性。使用嵌套PCR策略特异地扩增得到 AHAS基因的一个区域,并使用在Abi 3730x1上解析的BigDye 3.1对其进行直接测序。然 后用Sequencher v3. 7对所述序列进行比对并评估多态性。
[0093] 鉴定得到一些碱基突变的变种。在碱基坐标1431处,株系VBUT0810的G转变为 A。但是,这个改变可能不是观察到的除草剂抗性表型的原因,因为这个具体的核苷酸是三 联体密码的第三个碱基并且编码同一氨基酸因此是同义的。
[0094] 株系 νΒΗΤ0805(Ν(ΠΜΒ 41549)和 VBHT0806(NCnffi 41550)在碱基坐标 1742 处的 G突变为A,也是一个转换。这引起所得氨基酸由丝氨酸转换为天冬酰胺(图1)。
[0095] 使用跨种对比分析,发现已在株系νΒΗΤ0805(Ν(ΠΜΒ 41549)和νΒΗΤ0806(Ν(ΠΜΒ 41550)中被突变的丝氨酸在其他种中高度保守(图2)。
[0096] 将此丝氨酸向天冬酰胺的特异性变化与已知的使植物具有除草剂抗性的因果突 变(causal mutation)相比较,发现该变化符合先前鉴定和表征的变化(Li et al 2008; Jander et al. 2004 ;Sathasivan et al. 1990)〇
[0097] c.结论:
[0098] 突变体株系 VBHT0805(NCnffi 41549)和 VBHT0806(NCnffi 41550)可能由于坐标 1742处由G转换为A而表现出除草剂抗性,此改变使氨基酸从丝氨酸改变为天冬酰胺。此 突变被称作SER653。本发明的大麦表现的咪唑啉酮除草剂抗性与其他种中发现的水平相比 不同寻常地高。这是出乎意料的,不囿于任何理论,其可能是由于大麦中AHAS基因的高拷 贝数造成的。
[0099] 造成株系 VBHT0802、VBHT0803、VBHT0807、VBHT0809 和 VBHT0810 具有除草剂抗 性的突变目前未知。突变可能是在AHAS基因的未测序部分并且可能具有其他抗性机制。 VBHT0802与VBHT0805和VBHT0806相比对抗性有不同的遗传调节并且没有突变SER653。
[0100] 实施例 9 :对 VBHT0802、VBHT0803、VBHT0805、VBHT0806、VBHT0807、VBHT0809 和 VBHT0810的进一步测序。
[0101] 使用与实施例8相似的标准测序技术进行进一步的工作,以表征参与赋 予 VBHT0802 (NCIMB 41547)、VBHT0803(NCIMB 41548)、VBMT0805(NCIMB 41549)、 VBHT0806 (NCHMB 41550)、VBHT0807 (未保藏)、VBTIT0809 (NCHMB 41551)和 VBHT0810 (未 保藏)咪唑啉酮抗性的AHAS基因和其他可能的相关基因。
[0102] 即使在 νΒΗΤ0805(Ν(ΠΜΒ 41549)和 VBHT0806(NCnffi 41550)中鉴定到 SER653 突 变,也要对其进行进一步的测序,因为相信在所述基因的未测序部分可能还有其他突变。
[0103] 实施例10 :麦芽生产的适宜性
[0104] Buloke目前在澳大利亚被视为麦芽制造栽培种。根据欧洲酿造协会(European Brewing Congress)的标准方法对麦芽生产的适宜性进行测试。表8中显示的结果证明 VBHT0805(NCnffi 41549)在麦芽制造适宜性方面与Buloke相同。
[0105] 参考文献:
[0106] Li D. , Barclaya I. , Jose K. , Stefanova K. , Appels R. 2008. A mutation at the Alal22 position of acctohydroxyacid synthase(AHAS)located on chromosome 6D of wheat ;improved resistance to imidazolinone and a faster assay for marker selectiou. Mol Breeding. Published Online early.
[0107] Jander G.,Baerson S.,Hudak J.,Gonzalez K.,Gruys K.,Last R. 2003 Ethylmethanesulfonate Saturation Mutagenesis in Arabidopsis to Determine Frequency of Herbtcide Resistance. Plant Physiologyl31 pl39_16.
[0108] Sathasivan K. , Haughn G. , Murai N. 1990 Nucleotide sequence ofa mutant acetolactate synthase gone from an imidazolinone-resistant Arabidopsis thaliana var. Columbia. Nucleic Acids Research 18 2188.
【主权项】
1. 一种抑制大麦植物周围的杂草生长的方法,包括: 种植: (a) -种由以NCHMB保藏编号NCHMB 41547或NCHMB 41551保藏的种子衍生的非天然 存在的大麦植物,所述非天然存在的大麦植物与野生型大麦植物相比具有增强的对咪唑啉 酮除草剂的抗性; (b) 由(a)的大麦植物的种子衍生的大麦植物;或 (c) 由(b)的大麦植物的种子衍生的大麦植物或大麦植物的后代;并且 向所述大麦植物及其周围施用足以抑制杂草生长的咪唑啉酮。2. 权利要求1的方法,其中所述方法包括种植一种由以NCHMB保藏编号NCHMB 41547 或ΜΠΜΒ 41551保藏的种子衍生的非天然存在的大麦植物,所述非天然存在的大麦植物与 野生型大麦植物相比具有增强的对咪唑啉酮除草剂的抗性。3. 权利要求1或2的方法,其中咪唑啉酮以在出苗后施用的咪草啶酸和灭草烟的组合 的形式使用。4. 权利要求3的方法,其中咪草啶酸和灭草烟的施用比例分别为12. 375g每公顷和 5. 625g每公顷;分别为24. 75和11. 25g每公顷;分别为41. 25和18. 75g每公顷;或分别为 49. 5和22. 5g每公顷。5. 权利要求1或2的方法,其中咪唑啉酮以甲咪唑烟酸和灭草烟的组合的形式使用。6. 权利要求5的方法,其中甲咪唑烟酸和灭草烟的施用比例分别为26. 25和8. 75g每 公顷;或分别为42和14g每公顷。7. -种种植大麦作物的方法,包括: 播种NCHMB保藏编号为NCHMB 41547或NCHMB 41551的种子;并且 在合适条件下培育所述种子和得到的植物来生产作物。8. 权利要求7的方法,其中施用咪唑啉酮除草剂以抑制作物中杂草的生长。9. 咪唑啉酮除草剂用于抑制大麦植物周围的杂草生长的用途,其中将所述咪唑啉酮施 用于与野生型大麦植物相比对咪唑啉酮除草剂抗性增强的大麦植物及其周围,所述大麦植 物为: (a) 由以NCHMB保藏编号NCHMB 41547或NCHMB 41551保藏的种子衍生的大麦植物; (b) 由(a)的大麦植物的种子衍生的大麦植物;或 (c) 由(b)的大麦植物的种子衍生的大麦植物或大麦植物的后代。10. 权利要求9的用途,其中所述与野生型大麦植物相比对咪唑啉酮除草剂抗性增强 的大麦植物是由以NCHMB保藏编号ΜΠΜΒ41547或NCHMB 41551保藏的种子衍生的大麦植 物。11. 权利要求9或10的用途,其中所述咪唑啉酮除草剂包括咪草啶酸和灭草烟的组合。12. 权利要求9或10的用途,其中所述咪唑啉酮除草剂包括甲咪唑烟酸和灭草烟的组 合。13. 权利要求9或10的用途,其中所述咪唑啉酮除草剂在出苗后施用。14. 权利要求11的用途,其中所述咪唑啉酮除草剂在出苗后施用。15. 权利要求12的用途,其中所述咪唑啉酮除草剂在出苗后施用。
【专利摘要】本申请公开对除草剂,特别是对咪唑啉酮除草剂的抗性增强的非自然存在的大麦植物。还公开大麦植物种子自身、包含赋予咪唑啉酮抗性的核酸序列的分离的核酸、抑制大麦植物周围的杂草生长的方法和种植大麦作物的方法。种子保藏于NCIMB。NCIMB 4154720080418
【IPC分类】A01G1/00, A01H5/00
【公开号】CN105284628
【申请号】CN201510575739
【发明人】M·梅特尼, C·皮塔克, D·穆迪
【申请人】维多利亚农业服务控股公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2009年5月6日
【公告号】CA2723105A1, CA2723105C, CN102202494A, CN102202494B, EP2288254A1, EP2288254A4, US8889951, US20110126327, US20150075070, WO2009135254A1
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