骨髓间充质干细胞的保存试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞保存液技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞的保存试剂及 其应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞治疗是将具有不断自我繁殖能力和多向化潜能的干细胞在体外培养后，再 将其移植入患者受损或缺损组织，从而实现对损伤组织的补充和修复。而目前能实现人骨 髓间充质干细胞分离并大规模培养的细胞很少，在细胞培养完成之后，同时还需要对细胞 进行表型检测、细胞形状分析等等，之后将细胞保存在保存液中，待需要时再进行输注。在 人骨髓间充质干细胞培养后进行保存的阶段中，既要维持细胞的基本生命代谢以防止其死 亡，同时又要避免其代谢量过大而继续大量增殖产生的大量形状变异。所以细胞保存中，都 采用0.9WT%氯化钠注射液、5WT%葡萄糖注射液、复方电解质注射液（Plasmalyte A)、l~ 5WT %人血白蛋白溶液等作为细胞的保存介质来进行。
[0003] 但是细胞保存的过程中，采用上述MSCs的保存液进行保存，在需要保存时间较短 时（4h以内）细胞的性质和变化还能维持在比较正常的水平，细胞活性降低的程度还不会 大幅降低治疗的品质。但是如果保存的时间上进一步增加，进行稍长时间的保存时，首先细 胞具有表型异变、活性降低、聚集成团等倾向和性状变化更加明显，这些都会降低细胞的品 质影响治疗的效果；而上述保存液本身不具有缓解或者降低这些保存过程中问题的能力， 进行保存之后细胞活性大大降低，慢慢转向于休眠或者凋亡。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种能在骨髓间充质干细胞保存中 维持其细胞代谢状态和活性的保存试剂。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种骨髓间充质干细胞的保存试剂，包括0~100mmol/L的葡萄糖、40~50mmol/ L的甘露醇、24~28mmol/L的磷酸氢二钾、12~16mmol/L的磷酸二氢钾、3~4mmol/L的 腺噪呤、1~1. 5mmol/L的肌苷、14~18mmol/L枸橡酸钾、35~45mmol/L的氯化铵、75~ 80mmol/L的氯化钠及细胞抗氧化剂。
[0007] 本发明的上述骨髓间充质干细胞的保存试剂，通过葡萄糖、枸橼酸钾少数几种营 养维持细胞基本生命代谢，同时不添加大量丰富的营养避免其大量快速代谢和增殖；并且 进一步辅助腺嘌呤、肌苷、甘露醇维持细胞自身的形态和性状，保护细胞膜和酶活性的目 的，使保存的过程中细胞活性不发生退化；最后以细胞抗氧化剂抑制细胞的氧化损伤，相比 现有通常的保存液，保存后细胞具有更好的活性和品质。
[0008] 在本发明的上述骨髓间充质干细胞的保存试剂的基础上，本发明进一步还提出其 在骨髓间充质干细胞保存中的应用。采用上述保存试剂保存骨髓间充质干细胞，在保存中 保护细胞的能量产生机构，使其维持正常结构和功能；并尽量减慢细胞代谢速度，减少能量 消耗并供应能量物质，同时还维持细胞的形态抑制和分化和损伤，相比现有通常的保存液 保存后细胞具有更好的活性和形态。
【具体实施方式】
[0009] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0010] 本发明实例提出一种骨髓间充质干细胞的保存试剂，该保存试剂成分包括有 80~100mmol/L的葡萄糖、40~50mmol/L的甘露醇、24~28mmol/L的憐酸氛二钟、12~ 16mmol/L的憐酸二氛钟、3~4mmo1 /],的腺噪吟、1~1. 5mmol/L的肌昔、14~18mmo1 /],枸 橡酸钾、35~45mmol/L的氯化铵、75~80mmol/L的氯化钠及细胞抗氧化剂。
[0011] 本发明的上述骨髓间充质干细胞的保存试剂，是基于维持细胞基本代谢活性的同 时，一方面是保护细胞的能量产生机构，使其维持正常结构和功能；二是尽量减慢细胞代谢 速度，减少能量消耗并供应能量物质；并且辅助修复成分，降低保存过程中的细胞损伤。
[0012] 其中，细胞抗氧化剂比较中重要的补充性的细胞损伤修复和抑制工程成分，是能 清除自由基和抑制自由基活动的物质，能够预防自由基的形成，或是在自由基形成之后防 止它们与其他的细胞分子结合，从而阻止自由基造成细胞的衰老和氧化损伤。在实施中，上 述细胞氧化剂可以采用超氧化物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素 C、维生素 E及 还原型谷胱甘肽中的一种或多种。
[0013] 当然，最优选的是超氧化物歧化酶（S0D)，相对是人体不可缺少、重要的氧自由清 除剂，其以不稳定的自由基作为催化底物。这种酶对于需氧细胞的存活是比较重要的，它可 以催化清除超氧自由基，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶，所以在维护生 物机体内自由基产生与清除的动态平衡中起极其重要的作用。相比其他的基中细胞抗氧化 剂，其直接清除氧自由基，效果上更加明确，对抑制氧化性细胞损伤的针对性更强一些。
[0014] 另外，谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的过氧化物分解酶，是以硒半胱氨 酸结构为活性中心，能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从 而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害，主要针对于细胞膜结构的损伤修 复。其他的几种，维生素 C、维生素 E及还原型谷胱甘肽都是具有还原性的生物成分，能减缓 造成细胞氧化性损伤的氧化物质的氧化损伤。
[0015] 进一步在实施的过程中，由于上述细胞抗氧化剂的类型和成分并不相同，超氧化 物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶是属于蛋白质酶类，维生素 C、维生素 E是属于还原性维 生素，还原型谷胱甘肽是寡肽，添加的过程中分别按照各自适合的量进行添加，相互之间并 不存在统一的标准用量（酶类是以活力单位U计量、化学成分以mol、质量等方式计量）。 比如，实施中超氧化物歧化酶在保存试剂中控制添加量35000~45000U/L比较适中；谷 胱甘肽过氧化物酶其是过氧化物底物催化酶，相比产生的过氧化物量，控制添加20000~ 25000U/L的浓度范围即可；维生素 C和维生素 E这两者添加3~10mm〇l/L即可，在有上 述的酶共同协作使用时，在上述范围中采用低量添加；同时，由于还原型谷胱甘肽自身也是 多肽，添加量多有可能会作为C、N源进行能源代谢，可能也会诱导细胞产生分化，控制低量 1~1. 5mmol/L即可，在于上述多种抗氧化剂共同使用时，在上述范围下可以采用低量添 加。
[0016] 在细胞氧化损伤良好缓解的情形下，剩下的成分即是在上述保护细胞的能量 产生机构使其维持正常结构和功能、以及减慢细胞代谢速度并供应能量物质进行的采 用。比如，其中葡萄糖作为基本的生命能源；枸橼酸钾和氯化钠维持红细胞膜上钠钾栗 (Na+-K+-ATPase)的正常运转；腺嘌呤用于维持和恢复ATP、DPG水平，还能稳定干细胞形 态；肌苷与磷酸盐一方面是形成缓冲系，维持环境pH，同时还可以起到保护细胞膜和酶活 性的目的；甘露醇和氯化钠能维持适合细胞生存的晶体和胶体物质，保持合适的细胞外渗 透压，稳定细胞的膜结构。从上述选择可以看出，并不存在大量的多种营养，在保存中控制 细胞代谢速度处于较低的水平。
[0017] 在上述基础功能的立意下，本身骨髓间充质干细胞是属于比较容易分化的干细 胞，所以保存试剂如果自身具有了诱导细胞表型发生变化的成分，就很有可能会造成细胞 在保存的过程中产生分化；结合本案中不添加细胞因子等具有诱导效果的成分，并用肌苷、 甘露醇以及氯化钠在外环境中稳定细胞膜结构和形态，可以比较良好地抑制细胞的表型变 化或发生分化。
[0018] 同时，保存试剂在使用过程中，很大多数情形下均是将细胞置于常规空间内，而不 是无菌环境，所以有必要进一步添加抑制杂菌污染的抗生素试剂；基于本案中对骨髓间充 质干细胞保存的情况，在保存试剂中采用添加5~10mm〇l/L的氯霉素，氯霉素相比其他类 型的抗生素，其属于抑菌性广谱抗生素。本发明中一方面是基于其广谱性采用，以避免窄谱 性的抗生素的抑菌类型过少而达不到良好的抑菌效果；另一方面，其主要是抑菌性的类型， 而不是杀菌性的类型；这样可以最大化地避免对骨髓间充质干细胞自身的代谢产生杀伤。
[0019] 同时，本发明的上述保存试剂在制备的过程中，虽然基本上绝大多数成分都是水 溶性的（维生素 E属于脂溶性），同时氯霉素在冷水中溶解比较慢且溶解度非常低；所以本 案的保存液在配置的过程中可以将除细胞抗氧化剂的酶类之外的成分全部添加完成之后， 整体可能并不能直接完全溶解，而是呈胶状的悬液，可以采用适当加热至悬液呈现比较均 一之后进行分装和高温灭菌处理；并且在灭菌处理完成之后，最后再添加超氧化物歧化酶 (S0D)和谷胱甘肽过氧化物酶，以避免提前添加导致在后续的灭菌处理中变性失活。同时， 由于配置之后，可能并不一定会立即将上述试剂进行细胞保存，而长期存放的过程中超氧 化物歧化酶（S0D)和谷胱甘肽过氧化物酶可能自身可能还是容易降解或者失活，所以长期 保存可以按照上述方式配置好之后冰冻保存；或者是配置完成之后，暂时不添加超氧化物 歧化酶（S0D)和谷胱甘肽过氧化物酶这两种，而在使用之间添加即可。
[0020] 采用本发明的上述骨髓间充质干细胞的保存试剂，通过葡萄糖、枸橼酸钾少数几 种营养维持细胞基本生命代谢，同时不添加大量丰富的营养避免其大量快速代谢和增殖； 并且进一步辅助腺嘌呤、肌苷、甘露醇维持细胞自身的形态和性状，保护细胞膜和酶活性的 目的，使保存的过程中细胞活性不发生退化；最后以细胞抗氧化剂抑制细胞的氧化损伤，尽 可能地维持细胞的活性和品质。
[0021] 在本发明的上述骨髓间充质干细胞的保存试剂的基础上，本发明进一步还提出其 在骨髓间充质干细胞保存中的应用，采用上述保存试剂保存骨髓间充质干细胞，在保存中 保护细胞的能量产生机构，使其维持正常结构和功能；并尽量减慢细胞代谢速度，减少能量 消耗并供应能量物质，同时还维持细胞的形态抑制和分化和损伤，相比现有通常的保存液 保存后细胞具有更好的活性和形态。
[0022] 为使本发明的上述保存试剂的制备在骨髓间充质干细胞保存中实施能更易于本 领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明