一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及苹果树腐烂病的防治领域，具体涉及一种防治苹果树腐烂病的生防菌 发酵液的制备方法。
【背景技术】
[0002] 苹果树腐烂病是我国苹果产区危害较严重的病害之一。该病引起苹果树树皮腐 烂、树势衰弱、苹果产量和品质下降；严重时引起主杆以致整树枯死，甚至造成毁园。当前， 腐烂病严重制约着苹果产业的发展。农业部苹果现代产业技术体系调查表明：苹果树腐烂 病总体发病率达52. 7%。随着树龄的增大，腐烂病发病株率提高，4-10年生果树株发病率 为26. 8 %，11-17年树龄的果树株发病率为54. 0 %，18-24年生果树株发病率为59. 3 %。当 前，生产上主要使用化学药剂防治苹果树腐烂病病。然而，长期大量使用化学药剂不仅使果 园生态环境恶化并给食品安全带来极大隐患，而且容易导致腐烂病菌抗药性菌株的出现。 尽管化学药剂在农业生产仍占主导地位，但寻求对环境友好且高效的防治方法已成为亟待 解决的问题。
[0003] 生物防治技术作为一种安全有效的防治措施越来越受到人们的关注。国内外学者 先后报道哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、深绿木霉（Trichoderma atroviride)、螺旋 毛壳（Chaetomium spirale)、内生放线菌、链霉菌等对苹果树腐烂病菌具有诘抗作用。目 前，应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌（Bacillus)、假单胞杆菌（Pseudomonas)、土壤放 射杆菌（Agrobacterium radiobacter)等。其中，枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)是 一种革兰氏阳性杆状细菌；其抑菌范围很广（包括番茄叶病、枯萎病、黄瓜枯萎病、霜霉病、 灰霉病、白粉病、腐烂病等），是一种理想的生防微生物。枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相 对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，符合现代社会对农业生产及有害生物综合 防治（IPM)的要求。
[0004] 然而不同来源的枯草芽孢杆菌（B. subtilis)菌株生长过程中产生的枯草菌素、 多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质含量差异较大，导致不同来源枯草芽孢杆菌菌株 在抑菌效果方面表现出显著差异性。此外，单纯生防菌发酵液防治苹果树腐烂病存在防治 效果不稳定、拮抗菌抑菌物如何有效作用于病原菌等诸多问题。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方 法，所得的生防菌发酵液可有效防治苹果腐烂病，对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产 生抗药性、伤口愈合快、病疤复发率低。
[0006] 本发明从山西省苹果产区临汾市苹果园的果树枝干上分离筛选获得2株抑制苹 果树腐烂病菌较好的菌株LF17、LF18,经菌株菌落特征、菌株显微特征及16SrDNA序列分析 鉴定为枯草芽孢杆菌（B. subtilis)，该菌株保存于山西省农业科学院植物保护研究所菌种 库，枯草芽孢杆菌LF17的保藏号为NO :SAASIPPLF17 ;枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为N0 : SAASIPPLF18
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0008] -种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
[0009] S1、培养基的制备：
[0010] NA 培养基：称取酵母浸膏 10. 0g，牛肉浸膏 15. 0g，MgS04 · 7H20 0· 5g，FeS04 · 7H20 0· 009g，琼脂粉8. 5g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加 NaOH或HC1调节pH至6. 5,加水 定容至1L，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121°C高压蒸汽灭菌20min ;
[0011] NB 培养基：称取酵母浸膏 10. 0g，牛肉浸膏 15. 0g，MgS04 · 7H20 0. 5g，FeS04 · 7H20 0. 009g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加 NaOH或HC1调节pH至6. 5,加水定容至1L，分 装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121°C高压蒸汽灭菌20min ;
[0012] S2、拮抗菌株的活化：
[0013] 将菌株LF17、LF18的菌株接种在NA培养基上，25°C恒温培养2d，其中，枯草芽孢 杆菌LF17的保藏号为NO :SAASIPPLF17 ;枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为NO :SAASIPPLF18 ;
[0014] S3、拮抗菌株的液体培养：
[0015] 挑取步骤S2中活化的菌株LF17、LF18接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基； 150r · min 恒温振荡培养5d，得到发酵液。
[0016] S4、过滤浓缩发酵液：
[0017] 将步骤S3中制备的发酵液，经滤纸过滤后，浓缩为1. 5倍的原发酵液浓度和3. 0 倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液，4°C条件下保存备用；
[0018] S5、拮抗菌发酵液田间防治药剂的制备：
[0019] 将步骤S4所得的1. 5倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液与青霉素钠0. 001g · mL \ 溶液质量为3% -5%的矿物油、溶液质量为2% -3%的吐温80混合搅拌均匀，装瓶备用；
[0020] S6、拮抗菌发酵液膏剂田间防治药剂的制备：
[0021] 将步骤S4所得的1. 5倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液与青霉素钠0. 001g · mL \ 溶液质量为3 % -5 %的矿物油、溶液质量为2 % -3 %的吐温80、溶液质量为0. 5 %的黄原胶 混合搅拌均匀制成膏剂，装瓶备用。
[0022] 上述所得拮抗菌发酵液田间防治药剂的使用方法为：
[0023] 果树休眠期进行田间防治实验，在苹果树病疤周围延出0. 5cm处用刀割深达木质 部的保护圈，然后将圈内的病皮和健皮彻底刮除，尽量使伤口形状纵长、横窄，且周边圆滑， 刮掉的病组织集中烧毁；
[0024] 刮除病组织后，在已暴露的木质部涂少量上述配置好的发酵液防治药剂，稍等2-3 分钟，待药剂渗入后，用刀刮除木质部残留的病斑褐变组织，直到褐变组织完全刮完。在刮 好的病斑处涂抹上述配置好的发酵液防治药剂，使药剂完全覆盖病斑病外延1. 5cm，处理后 10天后再涂1次发酵液膏剂（黄原胶）或发酵液（含渗透剂等成分）。
[0025] 本发明具有以下有益效果：
[0026] 1)、本发明枯草芽孢杆菌（B. subtilis)菌株LF17、LF18发酵液对苹果树腐烂病 菌有显著的抑制作用，致使腐烂病菌菌丝颜色明显加深、顶端显著膨大、明显畸形、菌丝粗 细不均匀、有的菌丝分支增多、部分菌丝细胞质外渗。实施例的研究表明，发酵液对苹果树 腐烂病菌的抑制可达到99. 9%，抑菌效果高于化学药剂甲基硫菌（94.2% )、苯醚甲环唑 (81. 3% )。室内苹果离体枝条防治试验中，发酵液对苹果树腐烂病的防效为80. 04%，与化 学药剂苯醚甲环唑、甲基硫菌灵防效相当。
[0027] 2)、本发明将发酵液与青霉素钠按比例混用，提高了发酵液防治药剂的稳定性。 实验研究表明，含有0. 〇〇lg · mL 1青霉素钠 PDA培养基对苹果树腐烂病菌的抑制率达到 78. 6%，在含有0. 001g ·ιΛ 1青霉素钠的发酵液培养基上，对苹果树腐烂病菌的抑制率达到 96 %。本发明通过将发酵液与青霉素钠二者混合，提高了发酵液在田间的稳定性、防治效果 显著提高，从71. 76% (发酵液原液）提高至80. 04% (发酵液含青霉素等物质）。
[0028] 3)、本发明将拮抗菌发酵液与青霉素钠按比例混用，同时加入矿物油、吐温等物 质，提高了发酵液的渗透性，使之能有效渗透进入树皮，抑制病原菌、提高了防效。实施例的 研究表明，将发酵液、青霉素钠、矿物油、吐温按比例混合，可以有效防治苹果树腐烂病病， 治愈率约80%，伤口愈合平均宽度为9. 46cm2,病斑复发率为4. 21%。
[0029] 4)、本发明以枯草芽孢杆菌发酵液和青霉素钠为基础，是一种环境友好且高效防 治方法。实施例的研究表明，枯草芽孢杆菌发酵液对伤口愈合有促进作用，伤口愈合快，愈 合伤组织宽厚、病疤复发率低。已报道枯草芽孢杆菌发酵液中含有产生长素、赤霉素、细胞 分裂素等物质，并能促进植物生长。菌株LF17、LF18的发酵液中含促进果树伤口愈合的物 质，伤口木质部被愈伤组织完全封闭，能有效阻止了腐烂病的复发。
[0030] 5)、本发明以拮抗菌发酵液为基础，将发酵液、青霉素钠、矿物油、吐温、黄原胶等 物质按比例混合，制备出膏剂和水剂2种剂型。在果树休眠期，结合刮治病斑和涂抹拮抗菌 发酵液2种方法，能有效防治腐烂病。
[0031] 6)、本发明所提供的枯草芽孢杆菌（B. subtilis)菌株LF17、LF18发酵液防治效果 稳定，环境友好，生产工艺简单、生产成本低廉。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明实施例中菌株LF17、LF18的系统发育树。
【具体实施方式】
[0033] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0034] 实施例1
[0035] 筛选苹果树腐烂病菌拮抗菌
[0036] 在山西省苹果主产区运城市、临汾市苹果果园采集标本，从苹果树树皮上分离到 12株拮抗细菌，采用传统的平板对峙培养法进行初筛，筛选获得拮抗效果较好的拮抗菌。再 将得到的初筛菌株在NB培养基中进行液体发酵，利用发酵滤液进行复筛，最后得到对苹果 树腐烂病菌具有显著拮抗作用的菌株LF17、LF18 (见表1)。
[0037] 表1拮抗菌发酵液对腐烂病菌抑制效果
[0038]
[0040] 苹树腐烂病菌拮抗菌的鉴定
[0041] 形态特征：LF17、LF18菌株在NA培养基上菌落不规则、初期白色，后期为黄褐色、 中央略关起、不透明、镜检为杆状。
[0042] 16S rDNA序列分析：提取细菌基因组DNA，以细菌16S rDNA通用
[0043] 引物 27F (5' AGAGTTTGATCATGGCTCAG3')和
[0044] 1492R (5' GGTTACCTTGTTACGACTT3')对 DNA 模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增产物经切 胶回收后，进行序列测定。将所得序列在采用NCBI数据库中比对并下载同源序列，然后使 用BLAST、PAPU等软件构建系统发育树（图1)。
[0045] 结合菌落形态学特征、系统发育树分析，明确菌株LF17、LF18为杆菌枯草芽孢杆 菌（B. subtilis)〇
[0046] 实施例2
[0047] 制备拮抗菌发酵液
[0048] 活化筛选得到的拮抗菌：先将保存菌株LF17、LF18接种在NA培养基上，25°C恒温 培养2d。
[0049] 挑取活化的菌株LF1