壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种在植物幼苗培育上具有促生长、抗病诱导子作用的功能性寡糖， 具体设及壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用。
【背景技术】
[0002] 农作物在正常生长过程中，常受各种病害的侵犯，影响农作物的产量，而且人畜食 用患病作物后，可能会引起中毒。此外，一些优良品种往往因病害严重死亡而被淘汰，导致 了一些名贵稀缺品种的灭绝。通过对植物预先施加诱导子在植物体内诱发防卫反应，使其 处于敏感化状态，可对随后的病原物侵染产生系统抗性进而使植物自身具备抗病能力，抵 御病害。利用运种内在抗性机制控制病害，将成为发展可持续农业的有效途径之一。植物诱 导抗病性从广义上讲也属于生物防治的范畴，它是利用植物本身的防卫体系，借助于诱导 因子激发植物整体抗性水平，提高抵抗病害的能力，是植物病害防治的一种新思维。经过大 量试验表明植物诱导抗病性具有：（1)抗病的相对持久性和稳定性，而且往往具有系统性；
[2] 抗病的广谱性；(3)无污染等优点。正因为具备上述特点，近年来有关植物诱导抗病性 的研究与应用尝试有不断增长的趋势，将会在植物防病抗病方面发挥重要作用。
[0003] 在目前研究应用的诱导子中，寡糖W其天然性、无毒副作用、诱导活性高、能广谱 高效地增强植物抗病性和调节植物生长发育等优势，受到广泛的关注。寡糖诱导子是一类 能在DNA转录水平上调节特殊代谢基因表达的分子，可W激活植物的自我防卫系统，诱导 植物产生抑制多种病原物的抗菌物质如植保素、蛋白酶抑制剂、病程相关蛋白、木质素等的 合成，还可诱导植物与抗病相关的多种防御酶活性升高，从而提高植物的系统抗性。另外， 寡糖诱导子还可作为抗病信号物质诱导植物的抗病防卫反应。通过对农作物喷洒寡糖及其 衍生物，能控制植物开花、结实及其它生理活动，提高作物的产量和品质。据报道，寡糖类生 物农药具有水溶性好、对人畜无害、不污染环境、长期或多次诱导不会使植物产生特异抗病 性、使用剂量低且成本低廉等特点。寡糖农药在农作物病害防治中的安全性也是其一大特 色。随着人们对绿色食品的需求量日趋增加，寡糖农药的市场将越来越大，在农作物生长发 育和病害防治中具有广阔的应用空间。
[0004] 目前绝大多数研究主要集中在将寡糖作为喷施剂用于植物叶片，或对完整植株的 作用，或对作物产量的影响，但将寡糖应用于种子萌发和植物组织培养和器官再生的研究 国内还较少，虽然国外已有一些研究，主要的研究成果如下：寡糖能促进愈伤组织的增殖和 生长；在不添加生长素的条件下，增加小麦胚的不定根数量；调控番茄薄细胞层的器官再 生过程；抑制胡萝h离体培养胚胎的形成；促成胡萝h胚性细胞向体细胞胚的发生。尽管 如此，关于寡糖在植物离体培养形成愈伤组织及再分化的研究还不充分，缺乏系统性和大 量数据。因此研究寡糖在种子萌发和植物离体培养中的作用，为生产和保留名贵植物品种， 及植物脱毒、转基因研究提供理论基础，从而为发展我国现代农业提供可靠的技术支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足，提供壳寡糖作为抗病诱导 子在植物幼苗培育中的应用，能够促进种子萌发和植株愈伤组织及悬浮细胞的生长。
[0006] 本发明壳寡糖烟litosanoligosaccharide，CO巧是从邮蟹壳中提取出的一种天 然的、水溶性和稳定性较好、纯度较高的碱性寡糖，可W从市面上购买得到。
[0007] 本发明所述的壳寡糖（Qiitosanoligosaccharide，CO巧含量在90%W上。
[0008] 本发明的一个目的：壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用。
[0009] 所述的壳寡糖在作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用中，所述壳寡糖优选浓 度为1.O-I(K)卵m的水溶液。
[0010] 本发明的另一个目的：壳寡糖作为抗病诱导子在促进种子萌发中的应用。
[0011] 本发明所述的壳寡糖在促进种子萌发中的应用中，所述壳寡糖浓度优选为 50. 0-150.Omg/L的水溶液。
[0012] 本发明的另一个目：所述的壳寡糖在愈伤组织诱导中的应用。
[0013] 本发明所述的壳寡糖在愈伤组织诱导中的应用中，所述壳寡糖浓度优选为 1. 0-4.Omg/L的水溶液。
[0014] 科学研究发现，从邮蟹壳中提取的壳寡糖是一种很好的诱导因子，能够健进植物 生长和诱导提高植物的系统抗性，从而激活植物自身的防御反应，增强植物的杭病力，在农 业上具有很好的开发利用价值。
[0015] 本发明选取有代表性的蔬菜作物：黄瓜和番茄，分别探讨壳寡糖对黄瓜种子萌发 的促进效果、对番茄子叶愈伤组织诱导效果。通过浸种、水培等处理方式，分别测试黄瓜种 子萌发的相关指标，最终证明了壳寡糖对黄瓜种子萌发具有促进作用，并且能增强幼苗的 素质，促进壮苗的形成。丙二醒含量是植物抗病机制的重要生理指标，与植物的抗病性密切 相关。本发明通过测定与抗病相关的丙二醒的含量，确定经壳寡糖处理后，植株叶片的丙二 醒量显著增加。因此，壳寡糖是一种很好的抗病诱导因子，可W制备成寡糖生物农药加W应 用。相关实验数据将在实施例中详细说明。本发明从综合防治的角度，还可将壳寡糖作为 主要成份，配W其他成份制备成无公害农药，进一步开发壳寡糖的衍生产品。
【附图说明】
[0016] 图1壳寡糖对黄瓜种子活力指数的影响
【具体实施方式】
[0017] 实施案例一：壳寡糖对黄瓜种子萌发的影响 阳〇1引 1材料与方法
[0019] 1.1材料与处理
[0020] 供试黄瓜种子"晨丰106"由海南晨峰种业有限公司生产。种子精选后，置于初始 溫度为45°c的水中浸泡9小时，后取出。用0. 3 %KMn〇4溶液消毒30min、无菌水冲洗3次 后均匀排列在培养皿中，进行发芽试验。
[0021] 1.2发芽试验
[0022]试验W蒸馈水为对照组（CK)，实验组用不同梯度浓度（0、5化pm、lOOppm、15化pm、 200ppm)的壳寡糖溶液处理。取直径为120mm的干燥培养皿，培养皿内W双层滤纸作为发 芽床。将种子整齐排列在培养皿中，每床摆放100粒吸胀的"晨丰106"黄瓜种子，每个浓度 处理重复3次，并用铅笔标上编号，放好种子，滴加溶液至保证双层滤纸湿润，溶液埋没种 子1/2即可。将上述培养皿移入溫度为25°C的人工培养箱中，光照强度为3000LX，每天观 察出苗及发芽情况（每天定时滴加蒸馈水±2.Oml和相应浓度的壳寡糖溶液，W保持培养 皿内培养液浓度不变）。按W下公式计算发芽势、相对发芽势、发芽率、相对发芽率。
[002引发芽势师）=前4d内正常发芽的种子数/供试种子数X100%
[0024] 发芽率（GP)=前4d内正常发芽的种子数/供试种子数X100%
[00巧]1. 2. 1幼苗形态指标
[0026] 在处理后的第15天，在每个浓度处理重复3次中分别随机抽取幼苗10株，测定其 株高、根长。
[0027] 1. 2. 2幼苗生长指标
[0028] 在处理后的第15天，在各处理3次重复中分别随机采样10株测定植株的地上部 鲜重、根鲜重和根冠比，并仔细观察幼苗的生长状况。
[0029] 1. 2. 3分光光度法测定叶绿素的含量
[0030] 在处理后的第15天，取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表 面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研鉢中，加少量石英砂、碳酸巧粉、3mL 乙醇95 %，研成均浆，再加乙醇10血，继续研磨至组织变白，静置3~5min。
[0031] 取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒将提取液倒入漏斗中，滤液流至 IOOmL栋色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研鉢、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗 中。
[0032] 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部冲入容量瓶中。直至滤纸和残渣中 无绿色为止。最后用乙醇定容至IOOmU摇匀得到叶绿体色素提取液。取叶绿体色素提取液 在波长665皿、645皿和652皿下测定吸光度，W95%乙醇为空白对照。
[0033] 1. 2. 4 丙二醒（MDA)含量
[0034] 在处理后的第15天，称取剪碎混匀的叶片0.5g，加入2ml10%TCA和少量石英 砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆于离屯、机上在4000r/min离屯、lOmin，吸取 上清液2ml(对照组加入2ml蒸馈水），加入2ml0. 6 %TBA溶液，混合后在沸水浴中反应 15min，迅速冷却后再离屯、IOmin，取上清液分别测定其在450皿、532皿和600皿波长下的吸 光值，按下列公式计算丙二醒的含量：
[0035] MDA的浓度（ymol/L) = 6. 4S值532-〇6〇〇) _ 0. 5抓側 W36]MDA的含量（ymol/g中W)=MDA浓度X提取液体积/叶片鲜重
[0037] 1. 2. 5测定抗逆指标脯氨酸（Pro)的含量 阳03引分别取0.Ig实验组和对照组的黄瓜叶化加入3血3%横基水杨酸（SSA)和少许 石英砂，充分研磨后用2血3%SSA冲洗研鉢，用离屯、机5000巧m离屯、lOmin，取其