用于选择显示减少的损伤诱导的表面变色的方法
【专利说明】用于选择显示减少的损伤诱导的表面变色的方法
[0001] 本申请是申请号为200780006285. 8的专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明设及用于针对其中存在的个体筛选植物或植物部分的群体的方法，所述个 体与对照植物或植物部分相比，显示减少的损伤诱导的表面变色。
[000引发明背景
[0004] 由于不断增加的需要，新鲜产品例如窝宦、意大利红生菜（radicchio)、苦宦和其 他蔬菜的加工近年来获得长足的发展。叶类蔬菜的收获和加工包括叶子的大量切割，运诱 导了强烈的损伤反应。该损伤反应导致加工的产品的快速变质。该变质表现在由于损伤表 面上和周围的酶促褐变或变粉红引起的变色、呼吸和由于蒸腾作用引起的变干。特别地，酶 促褐变或变粉红据认为是非常重要的，其直接或间接决定了鲜切包装的叶类蔬菜如窝宦和 意大利红生菜的总体质量。
[0005] 此外，作为变质的结果，微生物的数量可显著增加，运可W危害食品安全。加工的 窝宦的高度易腐坏的性质导致消费者感觉到强烈的变色（off-colour)、异味（off-odour) 和质地改变，运妨碍了比所谓的便利市场的流通增长更快速的增长。
[0006] 其他蔬菜如马铃馨、磨茹、块根芹菜、朝鲜劑和茄子，还有果实和花可经历不希望 的变色。例如，果实如香蕉、苹果、梨子、鳄梨、芒果、桃子和杏子等，当切成薄片或剥皮时，很 快变成褐色。当W加工的形式例如薄切片、切成的小方块、去皮的形式或在果实沙拉中提供 运些果实时，必须采取措施。
[0007] 切花花茎（化tflowerstem)(例如来自大下草或菊花）也可容易地变色，所述变 色从商业的观点来看是不希望的，因为消费者认为变色使花丧失了吸引力，从而减少了产 品的可销售性。
[0008] 为了抑制蔬菜例如窝宦中的变质过程，已发展了可用于减缓加工的窝宦的变质的 许多化学或物理的收获后处理方法。
[0009] 在运些方法当中包括在改变的大气下包装鲜切的叶类蔬菜、使用可食用的涂层、 热激处理和加入抑制酶促褐变的化学物质。
[0010] 当在低溫下在减少氧气的大气下包装鲜切窝宦时，可显著地减少酶促褐变。然而， 运样的改变的、低氧环境导致无氧呼吸，运产生了令人感觉非常讨厌的产品的异味和臭味。
[0011] 可食用的涂层是用作物理隔离屏障和有效保护产品免受各种变质例如蒸发和褐 变侵害的材料的薄层。运些涂层可W例如由树脂、多糖或蛋白质制成。
[0012] 已进一步证明，可通过在加工后即刻在45°C下使用90秒的短暂热激来防止鲜切 窝宦的褐变。热激很可能使蛋白质的生物合成从参与变色的酶转向热激蛋白，从而减少了 酶促褐变的能力。可选择地，可用参与变色通路的酶的热敏感性（thermosensitivity)来 解释热激处理对褐变的作用。
[0013] 可使用的化学物质可W是例如还原剂如维生素C、馨合剂如邸TA、络合剂如环糊 精和酶抑制剂如L半脫氨酸。化学物质在新鲜食品中的应用明显地牵设到食品安全性问题 和需要法规批准（regulatcxryapproval)。可W考虑上述收获后技术的组合，最终，使用的 方法是技术功效、成本和食品安全性之间的平衡结果。
[0014] 不论所使用何种技术，加工的蔬菜、果实和花的收获后质量的提高来之不易，从而 在本领域存在提供可选择的技术来消除或减少对使用物理或化学收获后技术的需要的明 确需要。
[001引发明概述
[0016] 本发明的目的是提供筛选方法，所述方法用于选择显示减少的损伤诱导的变色反 应的植物，从而提供对收获后的加工障碍例如酶促褐变或变粉红具有抗性的植物和从其产 生的后代。也可在植物的部分例如茎、种子、果实、叶、花、块茎、枝等中看到损伤引起的变 色。因此本发明的进一步目的是提供选择在它们的植物部分显示减少的损伤诱导的变色反 应的植物的筛选方法。
[0017] 因此本发明提供了用于针对其中存在的个体（所述个体与对照植物相比，显示减 少的变色）筛选植物或植物部分的群体的方法，所述方法包括：
[0018] a)提供植物群体或来自该群体的植物的部分；
[0019] b)任选地在植物或植物部分上产生损伤表面；
[0020] C)溫育植物或植物部分或在其上产生的损伤表面W允许在其内或其上发生变 色；
[0021] d)在植物或植物部分内或上观察变色；
[0022] e)将观察到的变色与在对照植物或植物部分中观察到的变色进行比较，从而鉴定 显示没有变色的或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分。
[0023] 本发明的方法具有两个主要的实施方案。在第一实施方案中，变色是内源性底物 转化的结果。该变色将在一定的环境下溫育植物或植物部分一定量的时间后自发地产生。 该情况下的变色是损伤诱导的。本发明特别地设及天然发生的酶促变粉红色和褐变反应。 本发明的筛选方法意欲用于鉴定不显示该反应或与对照相比显示减少的反应的植物。
[0024] 在第二实施方案中，变色由外源加入的底物的转化引起，当植物中的反应发生时， 所述底物可被转化成变成可见的有色底物。运样的颜色反应可W是或可W不是损伤诱导 的。其也发生在例如完整的种子的种皮中。本发明的筛选方法意欲用于鉴定不显示该反应 或显示与对照相比减少的反应的植物。
[0025] 后一种施用方案更特别地设及用于就针对其中存在的个体（所述个体与对照植 物或植物部分相比，显示减少的变色）筛选植物或植物部分的群体的方法，所述方法包括：
[0026] a)提供植物群体或来自该群体的植物的部分；
[0027] b)将植物或植物部分与底物一起溫育，所述底物可转化成有色色素从而允许在其 内或其上发生变色；
[0028] C)在植物或植物部分内或上观察变色；
[0029] d)将观察到的变色与在对照植物或植物部分中观察到的变色进行比较，从而鉴定 显示没有变色或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分。
[0030] 本发明的方法可用于可经历变色的任何植物，但特别适合用于产品，特别是用 于蔬菜或果实或用于花。该方法尤其适合于用于叶类蔬菜例如窝宦、意大利红生菜或苦 宦，适合用于块茎，如马铃馨或甘馨（sweetpotato),适合用于根类植物，例如块根芹菜 (celeriac)，适合用于枝条类（shoots),例如witloof或适合用于磨茹。此外方法可用于 果实，例如苹果、香蕉、鳄梨、桃子、梨子、杏子、芒果、茄子和适合用于花类或花茎类（flower stem)，例如大下草茎、菊花、朝鲜劑基部等。
[0031] 本发明的筛选方法意欲用于鉴定在一个或多个它们的部分或组织中具有减少的 损伤诱导的表面变色的植物。因此，为了进行筛选，使用易于变色的部分或组织是非常实用 的。在窝宦中，运样的部分或组织可W是叶或其部分例如叶的打孔部分，在香蕉中，可合适 地使用去皮果实的切片，在花类植物中，茎的切片是非常实用的受试载体（testvehicle)。
[0032] 然而，已发现还可在未受损伤的组织上检测变色。在实施例中，显示了完整的种皮 和根尖能够在外源加入的底物存在的情况下诱导颜色反应，所述底物在未受伤的情况下可 被转化成有色色素。该颜色反应的减少或不存在可用于筛选具有减少的变色的植物。
[0033] 在特定的实施方案中，该方法特别适合用于选择属于菊科（Asteraceae)的植 物，特别是窝宦属化ac化Ca)的植物和更特别地属于窝宦化ac化Casativa)种的植物 或属于菊宦属（Cichorium)的植物，和特别地属于菊宦（Cichoriumintybus)种和苦宦 (Cichoriumendivia)种的植物，所述植物显示不存在或减少的损伤诱导的表面变色
[0034] 使用本发明的方法筛选的植物群体可W是任何植物群体，但优选是具有许多不同 成员的变异植物群体，W增加发现显示减少的损伤诱导的变色的植物的机会。可通过使用 例如化学物质和/或福射的诱变处理产生运样的变异群体，所述变异群体在本文中被称为 突变体植物群体。可选择的群体是种质集合体，所述集合体是显示天然变异的植物的集合 体。此外，还可使用转基因植物的群体。
[0035] 适合地使用具有损伤表面的植物部分来进行本发明的方法。非常有用的受试样品 是通过对叶子穿孔产生的盘，即所谓的叶盘。可选择地，可使用有叶脉的叶类蔬菜的中脉组 织。合适地，从此类叶脉切取叶盘。在果实中，可评估分成二半的果实的切面或可选择地薄 切片或小方块的切面。对于花，茎的切片是非常有用的受试样品。
[0036] 合适地在水性环境中进行溫育。可用在湿润的滤纸上或滤纸间溫育的叶盘很好地 进行本发明的方法。然后在滤纸上可W非常清楚地看到围绕损伤的边缘的颜色反应。
[0037] 可选择地，水性环境包括水或溶液。在将在下面进一步说明的特定的实施方案中， 溶液包含底物，例如心3, 4-二径基苯丙氨酸。该化合物通过多酪氧化酶转化成黑色的色素 黑色素的产物。可用于在该方面筛选窝宦植物的可选择的化合物包括但不限于绿原酸、异 绿原酸、L酪氨酸和儿茶酪。
[0038] 还可使用亲本植物（所述亲本植物显示不存在或减少的损伤诱导的叶变色）的后 代进行本发明，从而证明后代仍然具有与在亲本植物中发现的相同的不存在或减少的损伤 诱导的叶变色。
[0039] 本发明还可在植物的部分上进行。植物部分如窝宦或苦宦的叶球或叶通常是具有 切面（所述切面可经历变色）的部分。其他部分是果实、枝、根、种子、块茎、花、茎等。
[0040] 在本发明的其他实施方案中，种子或萌发的种子可用作在外源加入的底物存在的 情况下在其上进行筛选方法的载体（vehicle)。在萌发的种子的情况下，幼根尖参与颜色反 应。
[0041] 就鉴定可用于加工的蔬菜的市场的突变体植物而言本发明在商业上具有极大的 吸引力。如上面所解释的，产品特别是新鲜果实和蔬菜的变色被认为是不想要的，因为消费 者拒绝变色的产品。
[004引发明详述
[0043] 当通过切割收获和加工窝宦时，产生许多叶损伤表面，所述叶损伤表面导致植物 或植物部分的显著反应，表现为损伤表面上或附近的褐色或粉红色变色。还可在远离叶的 中脉W及柄上的损伤表面的位置上观察到变粉红色。有时还可在即将收获前的阶段观察到 变粉红色，运据认为是由于农作物的非生物胁迫或过度成熟造成的。
[0044] 其他植物，特别是其他蔬菜、果实和花也易于变色。因此本发明的方法也是鉴定显 示减少的损伤诱导的变色反应的其他植物特别是其他蔬菜或果实或花的非常方便的筛选 方法。
[0045] 不同形式的变色受到酶活性的影响，所述酶活性由于损伤而获得强烈的增强且产 生了几种形式的多酪和来源于其的反应产物。
[0046] 参与褐变反应的重要的酶活性是PP0。与酶促褐变相关的PPO活性不限定于窝宦， 已描述了该PPO活性在许多其他植物物种中如苹果、香蕉和马铃馨中与收获后变质有关。 事实上，PPO被公认为是与许多加工的新鲜果实和蔬菜的收获后变质有关的最重要的酶之 O
[0047] 因此，PPO-直是目的在于减少或预防其活性W增加食品的收获后质量的许多技 术的祀标。PPO催化将存在于植物组织中的多酪氧化，从而形成邻酿的反应。然后，酶促和 非酶促反应导致褐色或黑色色素的形成。
[0048] 在许多植物种中，PPO由小的基因家族编码，所述基因家族的个体成员可具有指示 功能趋异的不同的时间和空间表达