苗染色体数均为21条（图 2)，全部为单倍体植株。
[0049] 2、小麦单倍体植株移栽
[0050] 取样根尖后的小麦单倍体试管苗移栽到盛有草炭± (大汉园艺产品，货号为： KLASMAN422)的花盆中（花盆直径25畑1，高度20cm;每个花盆中均匀渗入20g奥绿缓释 肥），每个花盆移栽3-4株，诱250ml自来水，每株苗用良好透光的一次性塑料水杯罩住，放 入5-8°C、光照条件的植物生长室中缓苗、春化（移栽10天后移去水杯），30天后将花盆移 至25°C、光照条件的植物生长室中生长，每3天诱250ml自来水。
[0051] 3、小麦单倍体植株秋水仙素处理
[0052] 移栽后的单倍体植株在25°C生长室中生长7天左右时，用微量移液器在每株植株 的根部加注2ml不同质量分数（0. 2%、0. 4%和0.6% )的秋水仙素溶液，每个质量分数水 平处理7-8株；24小时后诱250ml自来水，W后每3天诱250ml自来水；生长期间注意防治 晒虫和白粉病。成熟期调查结实性，判别染色体加倍效果。W质量分数为0%的秋水仙素溶 液为对照。
[0053] (=)不同质量分数秋水仙素溶液的加倍效果比较
[0054] 结果表明，不同质量分数的秋水仙素溶液处理的小麦单倍体植株都没有结实（表 1)，与对照（不加倍处理）的结果相同，说明秋水仙素溶液加注根部对小麦单倍体植株不具 有加倍效果。
[0055] 表1、不同质量分数秋水仙素溶液根部加注后小麦单倍体植株的加倍效果
[0057] 二、秋水仙素涂抹叶片对小麦单倍体植株的加倍效果试验
[0058] W小麦品种新春9号与玉米品种郑58杂交诱导的小麦单倍体幼苗为试验对象，小 麦与玉米杂交幼胚捶救培养和小麦单倍体植株加倍处理步骤如下：
[0059] ( 一）小麦单倍体植株的获得 W60] 1、小麦与玉米杂交
[0061] 将小麦品种新春9号和玉米品种郑58种植在中国农业科学院作物科学研究所溫 室（2014年11月，分期播种）；小麦品种新春9号抽穗时及时人工去雄、套袋（2015年2月）， 共去雄56穗；3天后收集玉米品种郑58的新鲜花粉授W去雄后的新春9号；先后于授粉后 24小时和48小时用DA处理液喷洒杂交穗各I次；授粉后18-19天取样杂交穗。
[0062] 2、小麦与玉米杂交幼嫩巧粒灭菌和小麦单倍体植株获得
[0063] 从小麦新春9号与玉米郑58杂交后的56个麦穗上收集了 620个幼嫩巧粒，70% 酒精表面消毒1分钟，15%次氯酸钢灭菌20分钟，无菌水冲洗5次；在解剖镜下取出小麦与 玉米杂交幼胚，将小麦与玉米杂交幼胚进行捶救培养：胚轴端向上接种至1/2MS培养基上， 每个培养管接种3-4个杂交胚，共接种杂交幼胚62个；先在黑暗、25°C条件下培养3天，然 后在光照、25°C条件下培养20天，最终获得了 49株试管单倍体植株（图3)。
[0064] (二）小麦单倍体植株染色体加倍 [00化]1、小麦单倍体植株染色体检查
[0066] 移栽前取49株小麦单倍体试管苗l-2cm长度的根尖，冰水处理24小时，然后浸泡 在酒精与乙酸溶液（酒精与乙酸的体积比为3:1)中固定24小时后放入95%酒精中保存。 经固定的根尖用IN肥1在60°C下水解14分钟，然后用醋酸洋红进行染色，在显微镜下观察 单倍体植株染色体。检查结果表明，获得的49株试管苗染色体数均为21条（图4)，全部为 单倍体植株。
[0067]2、小麦单倍体植株移栽
[0068] 取样根尖后的小麦单倍体试管苗移栽到中国农业科学院作物科学研究所溫室 (2015年3月），用透光性能良好的塑料布覆盖，移栽7天后掲开塑料布，根据±壤水分情况 及时诱水。溫室溫度为22-25°C。
[0069] 3、小麦单倍体植株秋水仙素处理
[0070] 小麦单倍体植株在溫室中生长至拔节期，用棉签薩取不同质量分数（0. 2%，0. 4% 和0.6% )的秋水仙素溶液，反复涂抹新生叶片中部，每个秋水仙素质量分数水平处理 12-13株。生长期间注意防治晒虫和白粉病。成熟期调查结实性，判别单倍体植株染色体加 倍效果。W质量分数为0%的秋水仙素溶液为对照。
[0071] (=)不同质量分数秋水仙素溶液的加倍效果比较
[0072] 结果表明，不同质量分数的秋水仙素溶液涂抹处理小麦单倍体植株叶片后，质量 分数为0. 4%的秋水仙素溶液处理的13株小麦单倍体植株中只有1株结实（表2)，加倍率 仅为7. 69%;质量分数为0.2%、0.6%秋水仙素溶液处理和对照（不加倍处理）植株中，都 没有发现结实植株，加倍率为0(表2);表明秋水仙素溶液涂抹小麦单倍体植株叶片虽有加 倍效果，但加倍效果很差。
[0073] 表2、不同质量分数秋水仙素溶液涂抹小麦单倍体植株的加倍效果
[00巧]=、秋水仙素培养基表面对小麦单倍体植株的加倍效果试验 阳076] W小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交诱导的小麦单倍体幼苗为试验对象，小麦 与玉米杂交幼胚捶救培养和小麦单倍体植株加倍处理步骤如下：
[0077]( 一）小麦单倍体植株的获得阳07引 1、小麦与玉米杂交
[0079] 将小麦品种CB037种植在中国农业科学院作物科学研究所试验农场（2015年1 月），播种后覆盖塑料布，出苗后掲去塑料（2015年3月）；将玉米品种郑58种植在中国农 业科学院作物科学研究所溫室（2015年2月，分期播种）；小麦品种CB037抽穗时及时人工 去雄、套袋（2015年5月），共去雄80穗；3天后收集玉米品种郑58的新鲜花粉授W去雄后 的CB037 ;先后于授粉后24小时和48小时用DA处理液（2, 4-DlOOmg/L和AGP2g/L)喷 洒杂交穗各1次；授粉后16-17天取样杂交穗。
[0080] 2、小麦与玉米杂交幼嫩巧粒灭菌和小麦单倍体植株获得
[0081] 从小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交后的80个麦穗上收集了 735个幼嫩巧粒， 70%酒精表面消毒1分钟，15%次氯酸钢灭菌20分钟，无菌水冲洗5次；在解剖镜下取出小 麦与玉米杂交幼胚，将小麦与玉米杂交幼胚进行捶救培养：胚轴端向上接种至1/2MS培养 基（固体）上，每个培养管接种3-4个杂交胚，共接种杂交幼胚49个；先在黑暗、25°C条件 下培养3天，然后在光照、25°C条件下培养20天，最终获得了 57株试管苗植株（图5)。
[0082] (二）小麦单倍体植株染色体加倍
[0083] 1、小麦单倍体植株秋水仙素处理
[0084] 小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交后获得的57株试管植株生长健壮后，用微 量移液器向每个试管中的培养基表面加入2ml不同质量分数（0. 2%，0. 4%和0.6% )的秋 水仙素溶液，每个质量分数水平处理10-21株，处理溫度为25°C;处理24小时后移栽。W 质量分数为0%的秋水仙素溶液为对照。 阳0化]2、小麦单倍体植株移栽
[0086] 将秋水仙素溶液处理的试管苗移栽到盛有草炭± (大汉园艺产品，货号为： KLASMAN422)的花盆中（花盆直径25畑1，高度20cm;每个花盆中均匀渗入20g奥绿缓释肥）， 每个花盆移栽3-4株，移栽后诱250ml自来水，每株苗用良好透光的一次性塑料水杯罩住， 放入5-8°C、光照条件的植物生长室中缓苗（移栽10天后移去水杯），15天后将花盆移至 25°C、光照条件的植物生长室中生长，每3天诱250ml自来水；生长期间注意防治晒虫和白 粉病。成熟期调查结实性，判别染色体加倍效果。
[0087] (=)不同质量分数秋水仙素溶液的加倍效果比较 阳08引结果如表3所示，对照（不加倍处理）的10株小麦植株都没有结实，加倍率为0 ; 培养基表面添加质量分数为0. 2%的秋水仙素溶液对13株小麦单倍体植株进行加倍，其中 10株结实，加倍率为76. 9 % ;培养基表面添加质量分数为0. 4%的秋水仙素溶液对21株 小麦单倍体植株进行加倍，其中20株结实，加倍率为95. 2% ;培养基表面添加质量分数为 0. 6%的秋水仙素溶液对13株小麦单倍体植株进行加倍，其中11株结实，加倍率为84.6% (表3)。对结实巧粒根尖细胞染色体进行观察，结果如图6所示，成功加倍植株的染色体数 目均为42条。
[0089] 表3、不同质量分数的秋水仙素溶液培养基表面添加后小麦单倍体植株的加倍效 果
[0090]
[0091] 上述结果表明：培养基表面添加秋水仙素溶液方式对小麦单倍体植株的加 倍效果明显，添加质量分数为0.2-0.6%秋水仙素溶液小麦单倍体植株的加倍效率达 76. 9-95. 2%，W质量分数为0. 4%秋水仙素溶液的加倍效果为最好，与对照（不加倍处理） 差异显著。
[0092] 综上所述，移栽前在单倍体试管苗培养基表面添加0. 2-0.6%秋水仙素溶液方式 对小麦单倍体植株的加倍效果非常明显，加倍率显著提高，明显高于目前应用的传统加倍 方法。
【主权项】
1. 一种单倍体植株染色体加倍的方法，包括如下步骤：将秋水仙素或秋水仙素水溶液 添加在长有单倍体植株的培养基表面，处理，得到加倍的单倍体植株，实现单倍体植株染色 体加倍。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述秋水仙素水溶液的质量分数为 0· 2-0. 6%〇3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述秋水仙素水溶液的质量分数为 0· 4%〇4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述处理的时间为24h。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述处理的温度为25°C。6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述单倍体植株为小麦单倍体 植株。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述小麦单倍体植株为小麦品种与玉米 品种杂交得到的小麦单倍体植株。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述小麦品种为科农199、新春9号或 CB037,所述玉米品种为郑58。9. 权利要求1-8中任一所述的方法在提高小麦单倍体植株染色体加倍率中的应用。10. 权利要求1-8中任一所述的方法在小麦育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：将秋水仙素或秋水仙素溶液添加在长有单倍体植株的培养基表面，处理，得到加倍的单倍体植株，实现单倍体植株染色体加倍。通过实验证明：本发明的方法不仅高效、简单、易行环保，对小麦单倍体植株的加倍效果具有普遍性，而且减少了秋水仙素的潜在污染，对于利用细胞工程途径改良小麦和小麦基因工程研究具有重要意义。
【IPC分类】A01H1/08, A01H4/00
【公开号】CN105340732
【申请号】CN201510882466
【发明人】叶兴国, 王轲, 张双喜, 林志珊, 杜丽璞, 刘畅, 刘会云, 王坤杨, 范春捆, 王婉晴, 腾丽杰
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月3日