动物模型及治疗分子的制作方法
【专利说明】动物模型及治疗分子
[0001]本申请是2010年7月7日提交的题为“动物模型及治疗分子”的中国专利申请201080040055.5的分案申请。
[0002]发明背景
[0003]本发明涉及被工程化为含有外源DNA如人免疫球蛋白基因DNA的非人动物和细胞，其在医药学和疾病研究中的应用，产生非人动物和细胞的方法，以及由这种动物产生的抗体和抗体链及其衍生物。
[0004]为了解决人源化抗体的问题，许多公司着手产生具有人免疫系统的小鼠。使用的策略是敲除ES细胞中的重链和轻链基因座，并用转基因互补这种遗传损伤，所述转基因被设计为表达人重链和轻链基因。尽管可以产生完全人抗体，但是这些模型具有一些主要限制:
[0005](i)重链和轻链基因座的大小(每个均几个Mb)使得不能将全部基因座导入这些模型中。结果获得的转基因品系具有非常有限的V区库(repertoire)，大多数恒定区缺失并且重要的远距离(distant)增强子区未包含在该转基因中。
[0006](ii)产生大插入体转基因品系的极低效率以及使其与重链和轻链敲除品系杂交及使其再次纯合的复杂性和所需时间，限制了可以进行分析最优化表达的转基因品系的数目。
[0007](iii)个体抗体亲和性很少达到可以得自完整(非转基因)动物的那些亲和性。
[0008]W02007117410揭示了表达嵌合抗体的嵌合构建体。
[0009]W02010039900揭示了具有编码嵌合抗体的基因组的敲入(knock in)细胞和哺乳动物。
[0010]本发明提供了在非人哺乳动物中产生包含人Ig可变区的抗体的方法，及进一步提供了产生这种抗体的非人动物模型。
[0011]发明概述
[0012]一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含:
[0013](a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
[0014](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物K恒定区上游的一或多个人Ig轻链K V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链AJ区，
[0015]其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库或者嵌合轻链或重链库，所述嵌合抗体或嵌合轻链或重链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
[0016]一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含:
[0017](a)位于宿主非人哺乳动物K恒定区上游的多个人Ig轻链K V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链AJ区，及
[0018](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，
[0019]其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库或者嵌合轻链或重链库，所述嵌合抗体或嵌合轻链或重链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
[0020]—方面，本发明涉及非人哺乳动物细胞，其基因组包含:
[0021](a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
[0022](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物K恒定区上游的一或多个人Ig轻链K V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链λ J区。
[0023]—方面，本发明涉及非人哺乳动物细胞，其基因组包含:
[0024](a)位于宿主非人哺乳动物K恒定区上游的多个人Ig轻链K V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链AJ区，及
[0025](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区。
[0026]另一方面，本发明涉及产生非人细胞或哺乳动物的方法，包括将如下结构插入非人哺乳动物细胞基因组如ES细胞基因组中:
[0027](a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
[0028](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物K恒定区上游的一或多个人Ig轻链K V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链AJ区，
[0029]所述插入使得非人细胞或哺乳动物能产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体库，其中步骤(a)和(b)可以依次进行，步骤(a)和(b)每个步骤可以逐步进行或者单步进行。
[0030]插入可以通过同源重组进行。
[0031]另一方面，本发明涉及产生特异于希望的抗原的抗体或抗体链的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文揭示的转基因非人哺乳动物及回收所述抗体或抗体链。
[0032]另一方面，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文所述转基因非人哺乳动物，回收所述抗体或产生所述抗体的细胞，然后例如通过蛋白质或DNA工程将所述非人哺乳动物恒定区用人恒定区置换。
[0033]另一方面，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，其是嵌合的(如小鼠-人)和完全人源化形式的，本发明还涉及所述抗体和抗体链的片段和衍生物，以及所述抗体、抗体链及片段在医药学包括诊断中的应用。
[0034]另一方面，本发明涉及本文所述非人哺乳动物作为模型在检测药物和疫苗中的应用。
[0035]附图简述
[0036]图1-8示出将一系列人BAC插入小鼠Ig基因座中的重复过程(iterativeprocess)。
[0037]图9-18示出针对IgH和κ基因座的图1_8的更详细过程。
[0038]图19和20示出在嵌合小鼠中抗体产生的原理。
[0039]图21示出人DNA在小鼠染色体中的可能的插入位点。
[0040]图22-26揭示了将一系列人BAC插入小鼠Ig基因座的另一种重复过程。
[0041 ] 图27-29例证了宿主VDJ区倒位的机制。
[0042]图30例证了使用RMCE方法插入质粒的原理证明。
[0043]图31例证了连续RMCE -整合进着陆垫(landing pad)中。
[0044]图32例证了成功插入着陆垫的证实。
[0045]图33例证了 3’末端消除(Curing)的PCR证实。
[0046]图34 例证了 BAC#1 和 PCR Diagnostics 的插入。
[0047]一般描述
[0048]小鼠的所有核苷酸坐标均来自NCBI m37, April 2007 ENSEMBL Release 55.37h，小鼠 C57BL/6J 品系。人核苷酸来自 GRCh37，Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37，大鼠核苷酸来自 RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w。
[0049]在本发明中，我们揭示了在非人哺乳动物如小鼠中构建嵌合人重链和轻链基因座的方法。本文中，在小鼠中进行的研究工作只是举例说明，除非特别说明，关于小鼠提及的也包括所有非人哺乳动物，小鼠是优选的非人哺乳动物。
[0050]一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含:
[0051](a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
[0052](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κ V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链λ J区；
[0053]其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体或者抗体链库，所述嵌合抗体或抗体链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
[0054]另一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含:
[0055](a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κ V区及一或多个人Ig轻链K J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链AJ区，及
[0056](b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；
[0057]其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库，所述嵌合抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
[0058]任选地，所述非人哺乳动物基因组被修饰为防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
[0059]一方面，插入的人DNA包含至少50%人重链可变(V)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一个方面全部人V基因。
[0060]一方面，插入的人DNA包含至少50%人重链多样性(D)基因，如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人D基因。
[0061]一方面，插入的人DNA包含至少50%人重链结合(J)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一个方面全部人J基因。
[0062]一方面，插入的人DNA包含至少50%人轻链可变(V)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一个方面全部人V基因。
[0063]一方面，插入的人DNA包含至少50%人轻链结合(J)基因，如至少60%、至少70 %、至少80 %、至少90 %及在一个方面全部人轻链J基因。
[0064]插入的人基因可以衍生自相同或不同个体，或者是合成的或代表人共有序列。
[0065]—方面，尽管V、D和J区的数目在人个体中是可变的，但是据认为在重链上是51个人V基因，27个D基因和6个J基因，在κ轻链上是40个人V基因和5个J基因，在λ 轻链上是 29 个人 V 基因和 4 个 J 基因(Janeway and Travers, Immunob1logy, Thirdedit1n)。
[0066]一方面，插入非人哺乳动物中的人重链基因座含有人V、D和J区库，其在基因组中与非人哺乳动物恒定区功能性排列，由此在人可变区与非人哺乳动物恒定区之间可以产生功能性嵌合抗体。这个全部的插入的人重链遗传材料在本文被称作人IgH VDJ区，包含来自编码人V、D和J部分的所有外显子及合适地相关内含子的人基因组的DNA。相似地，人Ig轻链κ V和J区在本文是指人DNA，其包含编码V和J区的所有外显子及适当地人基因组的相关内含子。人Ig轻链λν和J区在本文是指人DNA，其包含编码V和J区的所有外显子及适当地人基因组的相关内含子。
[0067]人可变区被合适地插入在非人哺乳动物恒定区上游，后者包含编码全部恒定区或者足够部分的恒定区所需的所有DNA，使得能形成能够特异性识别抗原的有效嵌合抗体。
[0068]—方面，所述嵌合抗体或者抗体链具有一部分宿主恒定区，足以提供抗体在宿主哺乳动物中天然发生的一或多种效应物功能，例如其能与Fe受体相互作用，和/或结合补体。
[0069]具有宿主非人哺乳动物恒定区的嵌合抗体或抗体链因此在本文不限于完整的恒定区，也包括嵌合抗体或抗体链，其具有全部宿主恒定区或者其足以提供一或多种效应物功能的部分。这也适用于本发明的非人哺乳动物和细胞及方法，其中人可变区DNA可以插入宿主基因组中，由此其形成具有全部或者部分宿主恒定区的嵌合抗体链。一方面，全部的宿主恒定区与人可变区DNA可操纵地连接。
[0070]本文中宿主非人哺乳动物恒定区优选是内源宿主野生型恒定区，位于野生型基因座，与重链或轻链相适合。例如，人重链DNA合适地插入在小鼠第12号染色体上，合适地邻近小鼠重链恒定区。
[0071]—方面，人DNA如人VDJ区的插入被靶向在小鼠基因组IgH基因座中J4外显子与Cu基因座之间；在一个方面，插入在坐标114,667,090与114,665，190之间，合适地在坐标114，667，091。一方面，人DNA如人轻链κ VJ的插入被靶向在小鼠第6号染色体的坐标70，673，899与70，675，515之间，合适地在第70，674，734位置，或者在λ小鼠基因座第16
号染色体上的等价位置上。
[0072]—方面，形成嵌合抗体的宿主非人哺乳动物恒定区可以在不同的(非内源)染色体基因座。在这种情况中，插入的人DNA如人可变VDJ或VJ区随后可以插入非人基因组中与天然发生的重链或轻链恒定区的位点不同的位点。天然恒定区可以在位于与天然位置不同的染色体基因座插入该基因组中或者在该基因组中复制，由此其与人可变区功能性排列，由此仍可以产生本发明的嵌合抗体。
[0073]一方面，人DNA插入在内源宿主野生型恒定区，位于宿主恒定区与宿主VDJ区之间的野生型基因座。
[0074]位于非人哺乳动物恒定区上游的可变区的位置是指两个抗体部分-可变区与恒定区-的适当相对位置，使得所述可变区与恒定区在哺乳动物体内形成嵌合抗体或抗体链。因此，插入的人DNA与宿主恒定区是彼此功能性排列的，用以产生抗体或抗体链。
[0075]—方面，插入的人DNA通过同种型转换能与不同的宿主恒定区表达。一方面，同种型转换不需要或涉及反式转换(trans switching)。人可变区DNA插入在与相关宿主恒定区相同染色体上意味着不需要反式转换以产生同种型转换。
[0076]如上所述，用于现有技术模型中的转基因基因座是人源的，因此即使在所述转基因能与小鼠基因座互补由此小鼠产生可产生完全人抗体的B细胞的情况中，各个抗体亲和性也很少能达到可得自完整(非转基因)小鼠的那些水平。这个原因是(除了上述库和表达水平之外)所述基因座的控制元件是人的。因此，损害了信号传导成分如激活高亲和性抗体的超变和选择的成分。
[0077]相反，在本发明中，宿主非人哺乳动物恒定区被保留，并且优选至少一个非人哺乳动物增强子或者其它控制序列如转换区被保留与非人哺乳动物恒定区功能性排列，由此如在宿主哺乳动物中可见的增强子或其它控制序列的作用在所述转基因动物中完全或者部分发挥。
[0078]上述方法被设计为使得人基因座的全部多样性均被取样，使得通过非人哺乳动物控制序列如增强子达到同样高水平表达，由此在B细胞中的信号传导例如使用转换重组位点的同种型转换将仍使用非人哺乳动物序列。
[0079]具有这种基因组的哺乳动物将产生嵌合抗体，其具有人可变区和非人哺乳动物恒定区，但是这些抗体在例如一个克隆步骤中即可易于人源化。此外，这些嵌合抗体的体内效力可以在这些相同动物中评估。
[0080]一方面，插入的人IgH VDJ区包含以种系方式排列的(germline configurat1n)来自人的所有V、D和J区及间插序列。
[0081]—方面，将800-1000kb的人IgH VDJ区插入非人哺乳动物IgH基因座，一方面，插入940、950或者960kb片段。合适地，这包括来自人第14号染色体105，400, 051-106, 368，585的碱基(对于人基因组，所有坐标均参照NCBI36，对于小鼠基因组，坐标参照ENSEMBL Release 54和NCB頂37，涉及小鼠株系C57BL/6J)。
[0082]—方面，插入的IgH人片段由来自第14号染色体105，400, 051-106，368，585的碱基组成。一方面，插入的人重链DNA如由来自第14号染色体105，400, 051-106, 368，585的碱基组成的DNA插入在小鼠第12号染色体的小鼠J4区末端与E μ区之间，合适地在坐标114，667,091 与 114，665，190 之间，优选在坐标 114，667,091。
[0083]—方面，插入的人κ VJ区包含以种系方式排列的来自人的所有V和J区及间插序列。
[0084]合适地，这包括来自人第2号染色体88，940，356-89, 857，000碱基，合适地大约为917kb。另一方面，轻链VJ插入物可包含仅V节段和J节段的近端簇(proximal clusters)。这种插入物是大约473kb。
[0085]一方面，人轻链κ DNA如由来自人第2号染色体88，940, 356-89，857，000的碱基组成的人IgK