一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种CIK细胞的冻存方法及CIK细胞的冻存 介质。
【背景技术】
[0002] 细胞因子诱导的杀伤细胞（c5rtokineinducedkillercells,CIK细胞），是将 人外周血、厮血或骨髓的单个核细胞在体外用细胞因子培养一段时间后获得的一群异质细 胞。国内外多年的临床研究表明，CIK细胞治疗可W提高患者无病生存期和总生存期，提高 机体抗肿瘤免疫功能，改善患者生活质量。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白 分子，故又被称为NK细胞样T淋己细胞，兼具有T淋己细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非 主要组织相容性复合物（majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性杀瘤优点。
[0003] CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞为其主要效应细胞，具有增殖速°C快、杀瘤活性 高、杀瘤谱广、非主要组织相容性复合体（Mffi：)限制性、对正常骨髓造血影响轻微等优点。 特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有 重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生 命的积极作用。但是现有技术中的CIK细胞的制备技术中，存在CIK细胞增殖力差、细胞毒 活性低的缺点。而且诱导CIK细胞需要花费的周期很长，在临床上需要多次采血诱导，给患 者造成了极大的痛苦，浪费大量的医疗成本。因此，本领域的技术人员致力于开发一种CIK 细胞的保存方法，方便CIK疗法的临床应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种CIK细胞的冻存方法。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种CIK细胞的冻存介质。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种CIK细胞的冻存方法，包括步骤：
[0007] 1)分离CIK细胞
[0008] 将制备的CIK细胞培养液离必，800-1500巧m，离必3-5min，将上清置于-80°C冻存 待用；
[0009] 2)冻存CIK细胞
[0010] 将步骤1)离必获得CIK细胞置于冻存介质中，-2(TC冷冻2-地，然后-8(TC冷冻 6-1化后存放于液氮中；
[0011] 其中，所述冻存介质包括：人血白蛋白30~IOOyg/ml、维生素E1~5yg/ml、谷 脫甘肤20~50Ug/ml、甘氨酸10~20Ug/ml。
[0012] 优选地，所述步骤2)中的冻存介质包括；人血白蛋白50~80Ug/ml、维生素E 2~4yg/ml、谷脫甘肤30~40yg/ml、甘氨酸15~20yg/ml。
[001引更优选地，所述步骤2)中的冻存介质包括；人血白蛋白60Ug/ml、维生素E3Ug/ 1111、谷脫甘肤4011旨/1111、甘氨酸1511旨/1111。
[0014] 在另一优选例中，所述冻存介质中还包括比-630~50ng/ml和/或比-220~ 40ng/ml。
[001引 优选地，所述冻存介质中还包括比-6 40ng/ml和/或比-2 30ng/ml。比-6和/ 或IL-2的添加能够显著增强复苏细胞的细胞毒活性。
[0016] 在另一优选例中，使用生理盐水配制所述冻存介质。
[0017] 在另一优选例中，所述冻存介质的抑为6. 0-7. 5,优选地，抑为6. 2-7.0,更优选 地抑为6. 2-6. 4。
[0018] 在另一优选例中，所述方法包括CIK细胞复苏的步骤：
[0019] 3)将步骤1)中冻存的上清液解冻后离必，得到经过离必处理的上清液；
[0020] 4)将冻存的CIK细胞放入35~40°C的温水中速融，然后用生理盐水洗涂一次，加 入步骤3)中经离必处理过的上清液，置于培养箱中培养。
[0021] 本发明的另一方面，提供了一种CIK细胞的冻存介质，所述冻存介质包括；人血白 蛋白30~IOOyg/ml、维生素E1~Syg/ml、谷脫甘肤20~50]ig/ml、甘氨酸10~20]ig/ mlO
[002引 优选地，所述冻存介质中还包括比-6 30~50ng/ml和/或比-2 20~40ng/ml。
[0023] 在另一优选例中，使用生理盐水配制所述冻存介质。
[0024] 在另一优选例中，所述冻存介质的抑为6. 0-7. 5,优选地，抑为6. 2-7. 0,更优选 地抑为6. 2-6. 4。
[0025] 本发明中的冻存介质，能提高细胞膜对水的通透性，另外采用快速冻存的方法，能 保证细胞外结晶在很短的时间内即冻住，避免由于缓慢冻存使水分渗入细胞内形成胞内冰 晶对细胞造成伤害，造成细胞死亡。本发明的方法适用于对CIK细胞的长期保存，与现有技 术相比，不但省略了步骤，简化了工艺，实验结果表明复苏后的活细胞数能达到95%W上。
[0026] 利用该冻存介质冻存的细胞具有高复苏率，不影响细胞生长特性，复苏后细胞保 持CIK细胞的细胞毒活性等特点。冻存介质中的各组分不影响后续临床细胞治疗的应用。
【附图说明】
[0027] 图1显示了本发明复苏的CIK细胞的活细胞率。
[002引图2显示了本发明复苏的CIK细胞的细胞毒活性。
【具体实施方式】
[0029] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举W下实施例详细说明。但本发明 并不受实施例的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，为遵照常规方法和厂家 提供的操作说明执行。
[0030] 实施例ICIK细胞的冻存
[0031] CIK细胞的冻存及复苏包括W下步骤：
[0032] 一、CIK细胞的冻存
[0033] a.取CIK细胞（CIK细胞可WW本领域常规的方法进行制备，如可W参考中国专利 CN201210324368. 4中的方法），1000巧m离必5min，取出上清液于-80°C冷冻备用。
[0034] b.使用生理盐水按照下表配制冻存介质
[0035]
[0037] c.离必获得CIK细胞分别置于冻存介质中，还原至原CIK培养液体积的30~ 60%，-20°C冷冻3小时，然后放入-8(TC冰箱冷冻化后放于液氮中冻存。
[0038] 二、CIK细胞的复苏
[0039] d.取出步骤a中冻存的上清液于4°C冰箱中解冻，然后将上清液2000巧m离必 5min，取上清液备用，得到经过离必处理的上清液。
[0040] e、将冻存的CIK细胞放入37°C的温水中速融后加入装有生理盐水的离必管中 1000巧m离必5min，弃上清液。
[0041] f、将CIK细胞放入到步骤d中经过离必处理的上清液中，然后将细胞浓度稀释到 1.OXl〇6/ml后均分于六孔板中培养。
[0042] 实施例2 =CIK细胞的检测
[004引 UCIK细胞活细胞检测
[0044] 取复苏的CIK细胞lOOul，加入IOOul0.4%胎盘藍染色液，活细胞不被染色，死细 胞都被染成藍色。实验结果如图1所示，从图中可W看出，本发明的冻存介质能够使复苏细 胞的活细胞率达到99%，但是冻存介质的抑对细胞复苏影响很大，当抑低至6时或者当 抑高至6. 5W上时，活细胞率显著降低。
[0045] 2、CIK细胞毒活性检测
[0046] 将实施例1中复苏的各组CIK细胞按效祀比例10 : 1加入K562肿瘤细胞株（购 自武汉普诺赛生命科技有限公司）细胞接种24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入 新鲜配制的5mg/ml的MTTlOU1，共同培养4小时，离必吸弃上清液，每孔加DMS0100U1振 荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、祀细胞对照、 效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，W杀伤率计算效应细 胞的细胞毒活性，杀伤率（％)=[祀细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值）]/ 革己细胞对照A值X100%。W未经冻存的CIK细胞为对照，设置其杀伤率为100%。
[0047] 结果显示本发明的方法复苏的CIK细胞能够达到对照组活性的95%W上。另外， 冻存介质中添加IL-6和IL-2,能够显著提高复苏的CIK细胞的细胞毒活性而且同时添加 IL-6和IL-2的效果要显著优于单独添加IL-6或IL-2。
[0048] 本实施方式中利用冻存技术保存CIK细胞并保持了它的杀伤活性。CIK细胞冻存 后可W根据需要随时复苏，复苏时间仅需要1~2天，避免了临床使用CIK细胞需要多次诱 导的麻烦和多次采血给患者造成的痛苦，极大的方便了临床使用，降低了医疗成本。
[0049] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可W根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种CIK细胞的冻存方法，其特征在于，包括步骤： 1) 分离CIK细胞 将制备的CIK细胞培养液离心，800-1500rpm，离心3-5min，将上清置于-80°c冻存待 用； 2) 冻存CIK细胞 将步骤1)离心获得CIK细胞置于冻存介质中，-20°C冷冻2-4h，然后-80°C冷冻6-10h后存放于液氣中； 其中，所述冻存介质包括：人血白蛋白30~100 μ g/ml、维生素E 1~5 μ g/ml、谷胱甘 肽 20 ~50 μ g/ml、甘氨酸 10 ~20 μ g/ml。2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)中的冻存介质包括：人血白蛋白50~ 80 μ g/ml、维生素E 2~4 μ g/ml、谷胱甘肽30~40 μ g/ml、甘氨酸15~20 μ g/ml。3. 如权利要求1所述的方法，其中，所述冻存介质中还包括IL-6 30~50ng/ml和/或 IL-2 20 ~40ng/ml。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述冻存介质的pH为6. 0-7. 5,优选地，pH为 6. 2-7. 0,更优选地pH为6. 2-6. 4。5. 如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括CIK细胞复苏的步骤： 3) 将步骤1)中冻存的上清液解冻后离心，得到经过离心处理的上清液； 4) 将冻存的CIK细胞放入35~40°C的温水中速融，然后用生理盐水洗涤一次，加入步 骤3)中经离心处理过的上清液，置于培养箱中培养。6. -种CIK细胞的冻存介质，其特征在于，所述冻存介质包括：人血白蛋白30~ 100μg/ml、维生素E1~5μg/ml、谷胱甘肽20~50μg/ml、甘氨酸10~20μg/ml。7. 如权利要求6所述的CIK细胞的冻存介质，其中，所述冻存介质中还包括IL-6 30~ 50ng/ml和 / 或IL-2 20 ~40ng/ml。8. 如权利要求6所述的CIK细胞的冻存介质，其中，使用生理盐水配制所述冻存介质。9.如权利要求6所述的CIK细胞的冻存介质，其中，所述冻存介质的pH为6. 0-7. 5。10.如权利要求9所述的CIK细胞的冻存介质，其中，所述pH为6.2-6. 4。
【专利摘要】本发明公开了一种CIK细胞的冻存方法及CIK细胞的冻存介质。具体地CIK细胞的冻存方法包括步骤，将制备的CIK细胞培养液离心，800-1500rpm，离心3-5min，将上清置于-80℃冻存待用；将离心获得CIK细胞置于冻存介质中，-20℃冷冻2-4h，然后-80℃冷冻6-10h后存放于液氮中；其中，冻存介质包括：人血白蛋白30～100μg/ml、维生素E？1～5μg/ml、谷胱甘肽20～50μg/ml、甘氨酸10～20μg/ml。利用该冻存介质冻存的细胞具有较高的复苏率，复苏后细胞保持CIK细胞的细胞毒活性等特点。冻存介质中的各组分不影响后续临床细胞治疗的应用。
【IPC分类】C12N5/0783, A01N1/02
【公开号】CN105340876
【申请号】CN201410436792
【发明人】杨钟华
【申请人】瑞安市普罗生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年8月23日