Als抑制剂除草剂用于在对als抑制剂除草剂耐受的甜菜植物中防治不想要的植物的用图
【专利说明】ALS抑制剂除草剂用于在对ALS抑制剂除草剂耐受的甜菜 植物中防治不想要的植物的用途
[0001] 本发明涉及作物保护的技术领域，其通过使用ALS(乙酰乳酸合成酶；也被称作 AHAS(乙酰羟基酸合成酶（acetohydroxyacidsynthase) ;EC2. 2. 1. 6 ;旧版EC4. 1. 3. 18)) 抑制剂除草剂来对抗甜菜植物（优选糖用甜菜）生长区域中的不想要的植物，所述甜菜植 物通过在内源ALS基因中包含突变从而对ALS抑制剂除草剂耐受，所述内源ALS基因由此 编码在569位具有不同于天然存在的色氨酸（即野生型ALS蛋白质的色氨酸）的氨基酸和 在188位具有不同于天然存在的脯氨酸（即野生型ALS蛋白质的脯氨酸）的氨基酸的ALS 多肽。
[0002] 因此，本发明上下文中使用的突变型糖用甜菜植物在ALS基因中包含突变一一其 中在所编码的ALS酶的569位（对应于拟南芥（Arabidopsisthaliana)ALS酶的574位） 的色氨酸被另一个氨基酸（优选被亮氨酸）取代，并且在ALS基因中包含突变--其中在 所编码的ALS酶的188位（对应于拟南芥ALS酶的197位）的脯氨酸被另一个氨基酸（优 选被丝氨酸）取代。
[0003] 在温带和亚热带地区，甜菜的栽培型（如Ford-Lloyd(2005)Sourcesofgenetic variation,GenusBeta.In:BiancardiE,CampbellLG,SkaracisGN,DeBiaggiM(eds) GeneticsandBreedingofSugarBeet.SciencePublishers,Enfield(NH)，USA, 25-33页 所定义）是重要的农作物。例如，全世界约20%的糖产量基于糖用甜菜。因为甜菜幼苗和 幼株在其生命的头6-8周期间易受到由快速生长的杂草一一其与幼小的作物植株竞争并胜 出一一引起的强烈竞争的影响，因此在这些作物区域内迫切需要可靠的杂草防治措施。
[0004] 40多年前，除草剂为防治糖用甜菜（Betavulgarissubsp.vulgarisvar altissima)中的杂草的优选工具。用于此目的的产品，即甜菜宁（phenmedipham)、 desmediphan、乙氧咲草黄（ethofumesate)和苯嗪草酮（metamitron)可使在不损害作物 的情况下抑制糖用甜菜领域中的杂草。然而，在不利的环境条件下，这些产品的药效还 留有改进的空间，特别当有毒杂草如红心藜（Chenopodiumalbum)、反枝苋（Amaranthus retroflexus)和/或卷莖寥（Fallopiaconvolvulus)在延长的时期内发芽时。
[0005]ALS/AHAS酶存在于细菌、真菌和植物中，已经从各种有机体获得蛋白质分离 物并且其相应的氨基酸/核酸序列以及其生物化学特性已被确定/表征（综述，参见 Umbarger,Η.Ε. ,Annu.Rev.Biochem. (1978), 47, 533-606 ；Chiman,D.M.etal. ,Biochim. Biophys.Acta(1998), 1385, 401-419 ；Duggleby,R.G. ,andPang,S.S. ,J.Biochem.Mol. Biol. (2000),33, 1-36 ；Duggleby,R.G.(StructureandPropertiesofAcetohydroxyacid SynthaseinThiamine:CatalyticMechanismsinNormalandDiseaseStates,11 卷，MarcelDekker,NewYork, 2004, 251-274,）。
[0006] 在农业中，属于ALS抑制剂类的除草剂化合物用于在各种作物培养物中防治不 想要的植物的用途是众所周知的，所述除草剂化合物为例如（a)磺酰脲除草剂（Beyer Ε·Μ等人（1988)，SulfonylureasinHerbicides：Chemistry,Degradation,andMode ofAction;MarcelDekker，NewYork，1988, 117-189)，（b)横酰基氨基幾基三挫卩林酮除 草剂（Pontzen，R.，Pflanz._NachrichtenBayer，2002,55,37-52)，（c)咪唑啉酮除草剂 (Shaner,D.L.,等人，PlantPhysiol. , 1984, 76, 545-546 ；Shaner,D.L. ,and0'Connor,S. L. (Eds.)TheImidazolinoneHerbicides，CRCPress，BocaRato,FL, 1991)，（d)三挫 并啼啶除草剂（Kleschick,W.A.等人，Agric.FoodChem.，1992, 40, 1083-1085)，以及 (e)嘧啶基（硫代）苯甲酸盐除草剂（Shimizu,T.J.，Pestic.Sci.，1997, 22, 245-256 ; Shimizu,T.等人,AcetolactateSyntehaseInhibitorsinHerbicideClasses inDevelopment,Boger,P. ,ffakabayashi.K. ,Hirai,K. , (Eds. ) ,Springer Verlag,Berlin, 2002, 1-41)〇
[0007] 较多品种的ALS/AHAS抑制剂除草剂使农民能够防治宽泛范围的杂草种类而不考 虑其生长期，但是这些高效的除草剂不能用于甜菜（优选糖用甜菜），因为甜菜，特别是常 规的糖用甜菜植物/市售的糖用甜菜品种极易受到/被这些ALS抑制剂除草剂影响。然而， 这些ALS抑制剂除草剂针对阔叶和禾本科杂草种表现出优异的除草活性。基于ALS抑制剂 的首个除草剂已经在30年前被开发用于农业用途。现今，该类活性成分呈现出较强的杂草 防治能力并且广泛地用于玉米和谷物以及用于双子叶作物中，除甜菜、优选糖用甜菜外。
[0008] 迄今，仅存在一种基于磺酰脲除草剂的市售可得的产品，即Debut? (组分 (A)50%氟胺磺隆甲酯（triflusulfuron-methyl)+组分（B)特定的配方化合物，即特定的 佐剂），其可在糖用甜菜中用于出芽后施用，但是这需要在待处理的杂草的非常早的叶期施 用并且在处理糖用甜菜种植中的严重杂草生长时也显示出严峻的不足。该磺酰脲不被糖用 甜菜植物耐受而是在糖用甜菜植物中降解。
[0009] 获得能承受ALS抑制剂除草剂处理的甜菜（优选糖用甜菜）植物的另一种更可靠 且更灵活的方法是产生足以对农业上有用/需要量的ALS抑制剂除草剂耐受的突变体从而 在甜菜（优选糖用甜菜）中防治严重的不想要的植物。
[0010] 自从ALS抑制剂除草剂被引入农业中，已观察到易受影响的植物品种，包括天然 存在的杂草，偶尔形成对该类除草剂的自发耐受。在ALS基因特定位置的单碱基对替代通 常产生更多或更少的抗ALS酶变体，其显示出ALS抑制剂除草剂不同水平的抑制作用。
[0011] 因此，赋予突变型ALS等位基因的植物显示出对于ALS抑制剂除草剂不同程度的 耐受，这取决于ALS抑制剂除草剂的化学结构和ALS基因中点突变的位点以及由此编码的 ALS蛋白质。
[0012] 赋予对在上文给定的ALS抑制剂除草剂类/族下定义的一种或多种化学药品的 耐受性的ALS的一些突变体（在杂草中天然存在的以及在作物中通过突变或转基因方 法人工诱导的）在酶的各个部位是已知的（即在ALSh的α-、β-和γ-结构域是已 知的且已在包括下述植物的各种有机体中被识别（美国专利号5, 378, 82 ;Duggleby，R. G.等人，（2008)，PlantPhysiol,andBiochem·，309-324 页；Siyuan，T等人（2005)，Pest ManagementSci. ,61,246-257 页；Jung,S. (2004)BiochemJ·，53-61 页；Kolkman，J. M. (2004)，Theor.Appl.Genet. ,109, 1147-1159 页；Duggleby，R.G.等人（2003)3虹· J.Biochem·，270, 2895-2904 页；Pang,S.S·，等人（2003)，J.Biol.Chem·，7639-7644 页）；Yadav，N.等人，（1986)，Proc.Natl.Acad.Sci. ,83, 4418-4422 页），Jander G.等人（2003)，PlantPhysiol. ,131，139-146 页）；Tranel，P.J·，和扑181^，1'· R. (2002)，WeedScience, 50, 700-712 页）；Chang，A.K·，和Duggleby，R.G. (1998)，Biochem J.，333, 765-777 页）。
[0013] 赋予突变型ALS等位基因的作物植物，根据ALS抑制剂除草剂的化学结构和ALS 基因中点突变的位点，确实显示对ALS抑制剂除草剂不同程度的耐受。
[0014] 例如Hattorietal. (1995)，Mol.Gen.Genet. 246:419-425，描述了 在油菜 (Brassicanapus)细胞系中的色氨酸557密码子的单一突变（根据拟南芥（Arabidopsis thaliana)序列的编号一一其用在文献中以便比较所有的ALS/AHAS突变体一一这是指 "574"位）--这等同于糖用甜菜ALS多肽序列的569位。这些作者观察到对几个ALS抑 制剂除草剂子类的成员（如磺酰脲、咪唑啉酮和三唑并嘧啶）的抗性。
[0015] EP-A-0360750记载了通过在植物内部产生增加数量的受侵害的ALS来生产对ALS 抑制剂除草剂耐受的植物。这类植物显示出对某些磺酰脲类例如氯磺隆（chlorsulfuron)、 甲啼磺隆甲酯（sulfometuron-methyl)和醚苯磺隆（triasulfuron)的提高的耐受性。
[0016] US5, 198,599记载了通过选择过程已经获得的对磺酰脲和咪唑啉酮耐受的 植物且其显示出对氯磺隆、节磺隆（bensulfuron)、氯啼磺隆（chlorimuron)、噻吩磺隆 (thifensulfuron)和甲啼横隆（sulfometuron)耐受。
[0017] 此外，US5, 013, 659、US5, 141，870 和US5, 378, 824 记载了通过将改性的酵母 ALS基因引入至这类糖用甜菜植物中来生产转基因糖用甜菜植物。
[0018] 此外，Saunders等人（CropScience, 1992, 32, 1317-1320)公开了通过体细胞克 隆细胞选择获得的对磺酰脲耐受的糖用甜菜植物，但是这些作者没有给出关于这类植物对 ALS抑制剂除草剂处理的耐受程度的任何生物学数据也没有示出由产生这些突变的培养物 获得的基因稳定的突变体。
[0019] Tan等人在PestManag.Sci. 2005, 61，246-257报道了在某些对咪唑啉酮耐受的 作物中的杂草防治。
[0020] Stougaard等人（1990)，J.CellBiochem.，增刊 14E, 310 记载了在四倍体糖用 甜菜培养物中ALS突变体的分离。分离出仅在氨基酸37位有差别的两个不同的ALS基因 (ALSI和ALSII)。突变体1在其ALSI基因中包含2个突变，而突变体2在其ALSII基 因中包含3个突变。在分离突变体以解决哪一种突变会赋予对ALS抑制剂的抗性后，揭示 出由重组大肠杆菌（E.coli)合成的ALS具有除草剂抗性一一如果其在色氨酸574密码子 ((根据拟南芥序列的编号一一其用在文献中以便比较所有的ALS突变体）一一其等同于甜 菜ALS氨基酸序列的569位）中包含点突变，这导致氨基酸"色氨酸"被氨基酸"亮氨酸"替 代。Stougaard等人在糖用甜菜中没有显示出在任一糖用甜菜ALS基因569位的突变足以 获得对ALS抑制剂除草剂的农业上可接受程度的耐受性。而且，Stougaard等人没有再生 或处理包含突变一一包括在糖用甜菜ALS的569位的色氨酸-> 亮氨酸突变一一的糖用甜 菜植物。
[0021] 已知，Stougaard等人构建了包含不同的ALS基因的植物转化载体用于植物转化。 然而，此后20多年直至今天，这些作者或其他作者在基因改良植物或突变植物中没有公开 其他数据一一特别没有公开关于ALS抑制剂除草剂的施用对在甜菜植物中包含所述突变的 植物和/或农业领域的作用。
[0022] 此外，有记载甜菜突变体赋予在丙氨酸122密码子中的点突变，其引起对ALS抑制 剂除草剂子类的咪唑啉酮类的某些耐受性（W0 98/02526)但是其不足以用于农业施用方 案中的杂草防治。没有记载通过应用所述突变体对其他ALS抑制剂除草剂交叉耐受。此 外，赋予在脯氨酸197密码子中的第二点突变的甜菜植物显示出对属于磺酰脲除草剂子类 成员的ALS抑制剂除草剂的中度耐受。还记载了这两个的双突变体（W0 98/02527)。然而， 这些突变体没有用于甜菜品种的市场引入，因为这些突变体中对ALS抑制剂除草剂的除草 剂耐受程度不够高，不足以用于农业开发。
[0023] W0 2012/049268公开了生产对一些ALS抑制剂（包括对甲酰氨磺隆）具有抗性的 糖用甜菜植物的方法，其包括如下步骤：将获自甜菜的外植体的愈伤组织暴露于甲酰氨磺 隆；以及从可在这种除草剂的存在下生长的几种自发的突变体中再生植物。所述方法产生 在ALS基因中具有突变的植物，其中在所编码的ALS酶的569位（对应于拟南芥ALS酶的 574位）的色氨酸被亮氨酸取代。W0 2012/049266涉及ALS抑制剂除草剂用于在对ALS抑 制剂除草剂耐受的甜菜植物中防治不想要的植物的用途，所述甜菜植物在ALS基因中具有 突变，其中所编码的ALS酶的569位的色氨酸。
[0024] W0 2008/124495公开了ALS双突变体和三突变体。根据W0 2009/046334,提供了 ALS基因中的特定突变。然而，到目前为止，含有根据W0 2009/046334的所述突变且还显示 出对多种ALS抑制剂除草剂类的任何类的ALS抑制剂除草剂有足够耐受性的可农业开发的 甜菜突变体还没有获得/记载。
[0025] 所有这些糖用甜菜突变体未示出对多类ALS抑制剂除草剂的可靠的耐受和/或未 示出满意的耐受，并且更糟的是，其没有显示出在农业施用率下针对任何类的ALS抑制剂 除草剂充分且有用的耐受程度。
[0026] 因其涉及已知的作为ALS抑制剂除草剂的化合物，这些化合物可以分成几类。
[0027] 已知作为防治不想要的植物的除草活性化合物的（磺）酰胺类的化合物；参见，例 如EP239414、US4,288,244、DE3303388、US5,457,085、US3，120,434、US3,480,671、 EP206251、EP205271、US2,556,664、US3,534,098、EP053011、US4,385,927、EP 348737、DE2822155、US3,894,078、GB869169、EP447004、DE1039779、HU176582、US 3,442,945、DE2305495、DE2648008、DE2328340、DE1014380、HU53483、US4,802,907、 GB1040541、US2,903,478、US3，177,061、US2,695,225、DE1567151、GB574995、 DE1031571、US3，175,897、JP1098331、US2,913,327、W0 83/00329、JP80127302、 DE1300947、DE2135768、US3，175,887、US3,836,524、JP85067463、US3, 582, 314、US 5, 333, 0821、EP131258、US4, 746, 353、US4, 420, 325、US4, 394, 506、US4, 127, 405、US 4,479,821、US5,009,699、EP13606UEP324569、EP184385、W0 02/30921、W0 92/15576、 TO95/29899、US4,668,277、EP305939、W0 96/41537、W0 95/10507、EP007677、CN 01080116、US4,789,393、EP971902、US5,209,771、EP084020、EP120814、EP087780、 TO88/04297、EP5828924、WO02/36595、US5, 476, 936、WO2009/053058 以及在上述公开 文本中引用的文献。
[0028] 已知作为防治不想要的植物的除草活性化合物的咪唑啉酮类化合物；参见， 例如Proc.South.WeedSci.Soc. 1992. 45, 341，Proc.South.WeedSci.Soc.Annu. Mtg. 36th，1983, 29,WeedSci.Soc.Annu.Mtg. 36th，1983, 90-91，WeedSci.Soc. Mtg.，1984, 18,ModernAgrochemicals，2004, 14_15〇
[0029] 已知作为防治不想要的植物的除草活性化合物的嘧啶基（硫代）苯甲酸盐类化合 物；参见，例如US4,906,285、EP658549、US5，118,339、TO91/05781、US4,932,999 和EP315889〇
[0030] 已知作为防治不想要的植物的除草活性化合物的磺酰苯胺类（sulfonanilide) 化合物；参见，例如W093/09099、W0 2006/008159 和W0 2005/096818。
[0031] 本公开内容中引用的所有出版物和专利以引用的方式全文纳入本说明书。只要通 过引用方式纳入的材料与本说明书相抵触或不一致，则本说明书将废弃任何所述材料。
[0032] 鉴于例如糖用甜菜占据世界糖产量的约20%，非常需要获得这样的杂草防治体 系：其能够有效防治高强度和严重的杂草。因此非常需要使用一种或多种ALS抑制剂除草 剂用于在对所述ALS抑制剂除草剂耐受的甜菜植物（优选糖用甜菜植物）中防治不想要的 植物。
[0033] 该问题根据本发明得到解决。
[0034] 本发明涉及属于一类或多类ALS抑制剂除草剂的一种或多种ALS抑制剂除草剂用 于在甜菜（优选糖用甜菜）生长区域中防治不想要的植物的用途，其中所述甜菜植物（优 选糖用甜菜植物）包含在ALS酶的569位的色氨酸的突变以及在ALS酶的188位的脯氨酸 的突变，以及任选一种或几种其他突变，优选一种或几种在ALS基因中的其他突变，优选在 ALS基因中的引起其他氨基酸取代的突变。
[0035] 包含所述突变且根据本发明优选应用的糖用甜菜植物的种子已经在2012年9月7 日以编号NCHMB41705 保藏于NCHMB，Aberdeen,UK(BayerCropScienceAG为共保藏人）。
[0036] 更优选地，本发明涉及一种或多种ALS抑制剂除草剂在上述的突变型甜菜植物中 (优选在上述的突变型糖用甜菜植物中）的用途，其中所述ALS抑制剂除草剂属于：
[0037](磺）酰胺类（㈧组），由以下组成：
[0038]磺酰脲亚类（A1)，由以下组成：
[0039] 酰啼横隆（amidosulfuron)[CASRN120923-37-7] ( =A1-1);
[0040] 四唑嘧磺隆（azimsulfuron)[CASRN120162-55-2] ( =A1-2);
[0041] 节啼横隆（bensulfuron-methyl)[CASRN83055-99-6] ( =Al-3);
[0042] 氯啼横隆乙酯（chlorimuron-ethyl)[CASRN90982-32-4] ( =Al-4);
[0043] 氯磺隆[CASRN64902-72-3] ( =Al-5);
[0044] 酿黄隆（cinosulfuron)[CASRN94593-91-6] ( =Al-6);
[0045] 环胺横隆（cyclosulfamuron)[CASRN136849-15-5] ( =Al-7);
[0046] 甲基胺苯横隆（ethametsulfuron-methyl)[CASRN97780-06-8] ( =Al-8);
[0047] 乙氧横隆（ethoxysulfuron)[CASRN126801-58-9] ( =Al-9);
[0048] 啼啶横隆（flazasulfuron)