一种半夏试管微球茎的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养方法，尤其是一种半夏试管微球茎的制备方法。
【背景技术】
[0002]半夏是天南星科植物半夏[Pinellia ternata (Thunb.) Breit.]的块莖，始载于《神农本草经》，为我国传统的常用中药材，也是贵州著名地道药材。半夏性温，味辛，有小毒，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，用于痰多咳喘、呕吐反胃、胸腕痞满、梅核气、痈肿痰核等多种病症。目前，由于贵州地区多年来长期种植半夏，随之半夏种源病毒逐渐增多，种源退化、病害等现象日益凸显，导致半夏产量降低。虽然将组织培养技术成功用于半夏良种繁育及其试管苗移栽已有不少报道，然而半夏试管苗移栽工作量极大、成本高、没有推广应用价值的问题，加之半夏田问生产实行高密度种植，需要栽种25000?30000株/ 667m2试管苗，移栽和栽后管理工作量极大，成本高，因而该技术在半夏药材规模化人工种植中几乎没有推广应用的价值。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的不足之处，本发明旨在提供一种高效生产半夏试管微球茎的方法，本发明中半夏试管微球茎是指在组织培养条件下，以半夏块茎经过诱导出愈伤组织，脱去主要病毒，再用愈伤组织诱导出半夏组培芽，通过控制培养基成分和培养条件及环境温度，诱导试管苗形成微球茎，主要解决半夏繁殖速度和退化问题。
[0004]本发明采用的技术方案:一种试管微球茎的制备方法，包括如下操作步骤:
1.将半夏块茎接入培养基中诱导出愈伤组织后，进行继代增殖、芽的分化；
2.当经过诱导出的半夏组培芽长到有1?3cm长时，选取生长良好的芽，从愈伤组织处切下，使其带有一块愈伤组织，愈伤组织直径3±1 _，将半夏组培芽接入到诱导培养基中，芽留在培养基外面，诱导培养基的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.8 mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.8 mg/L、糖浓度为3 %，诱导培养基的肌醇浓度提高到500 mg/L，放入光照条件12h/d，光照时间为12 h/d，温度为23— 27°C左右的培养室中培养；
3.将带有愈伤组织的幼芽接入到培养基中后，在前10d愈伤组织继续增大，幼芽也迅速增长，在10 — 20 d中从愈伤组织上不断长出不定根，且愈伤组织不在增殖，表面变得平滑，有绿色的亮泽出现，在20— 30 d中植株不断成熟，同时，愈伤组织完全变成与半夏块茎外形、结构相似的幼小球茎；
4.将诱导出与半夏块茎外形相似的幼小球茎从培养基中取出洗净，将微球茎以上的半夏苗切除，保留球茎部分，并将获取的半夏微球放入到质量浓度为0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5 — 8min，然后放入到活性炭:滑石粉:多菌灵比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.1 mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.lmg/L、赤霉素GA3浓度为0.lmg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤2操作，放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5 — 7min取出置于空气中固化10_15min，再将已固化的半夏微球放入0.4%氯化钙溶液中侵泡l_2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装、贮藏。
[0005]上述方法繁殖速度快，生产效率高，生产成本低，能周年工厂化生产；生产出来的试管微球茎具有无病毒、体积小、贮藏运输方便特点，是一项具有产业前景，能从根本上解决半夏退化的先进方法。
【具体实施方式】
[0006]施秉县中药材种苗繁育组培室。
[0007]1.材料 1.1原材料
以天南星科半夏[Pinellia ternata (Thunb.)Breit.]块莖作为半夏愈伤组织的诱导材料，经继代培养分化成芽，再将分化出的芽作为微球茎诱导的材料。
[0008]2.愈伤组织的制备方法
2.1外植体的选择和预处理
在半夏出苗到倒苗期间，挖取长势较好的半夏块茎，反复用自来水冲洗30?40 min，以冲洗掉表面的泥土，并去掉块茎表皮，然后进行灭菌处理。
[0009]2.2灭菌处理
在无菌操作台上，先用75 %酒精消毒30 s后，用无菌水冲洗2 min，至少2次，再把外植体放入0.1 %的HgC12溶液中灭菌8 min,然后用无菌水冲洗6?8 min,至少冲洗5次，每一步都要不停的摇动，使材料、消毒液与无菌水充分接触，目的是提高消毒效果以及让无菌水更好的去除残留的消毒剂，降低消毒剂对材料的毒害作用。
[0010]2.3培养基的配制
在配制MS培养基时，MS培养基为现有技术，含有MS培养基0.7 %琼脂，MS培养基pH
5.8?6.0，由于MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，所以将培养基中的各种成分配成浓缩母液，包括大量兀素母液，微量兀素，有机物母液，铁盐母液，除了大量元素母液为20倍浓缩液之外，其他均为100倍的浓度，冷藏待用，本次所用植物生长调节剂为萘乙酸NAA、6-苄氨基腺嘌呤6-BA、6-糖基氨基嘌呤6-糖基氨基嘌呤KT，均配制为1 mg/mL的溶液，冷藏留待量取；
在配制培养基时，用移液管量取每种母液适宜的量，称取相应的蔗糖，琼脂，蔗糖和琼月旨，根据不同培养基的要求称取不同的量，用移液管量取设计培养基所需的植物生长调节剂量，搅拌均匀，定容至所需培养基容积，用电磁炉加热煮沸10 min左右以溶解琼脂，加热完毕后，加入蒸馏水定容，再用HC1和NaOH溶液调节pH值在5.8?6.0之间，分装进培养瓶，每瓶25 mL左右，用封口膜和胶圈密封培养瓶瓶口 ；
培养基倒好后，将培养瓶放入高压灭菌锅内灭菌，注意要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底完成，当锅内温度达121 °C，开始计时20 min，到时间后关闭电源，等灭菌锅压力降到常压后将培养瓶取出，放到指定位置冷却凝固后，即可放入培养基储存架上留待使用。
[0011 ] 2.4愈伤组织的诱导及继代增殖
愈伤培养基为MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，将经灭菌处理后的半夏块茎用消毒的手术刀和镊子切成直径为0.5?0.8 cm的均匀小块，接入愈伤培养基中，每瓶接入5块，诱导愈伤15?20 d，愈伤诱导出后，将诱导出的愈伤组织死亡和老化的部分切去，接入新鲜的继代培养基(MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3%蔗糖+0.7 %琼脂)中，切时应保持愈伤组织各块大小尽量保持一致，每15?20天转接一次。
[0012]3.芽的分化
分化培养基为MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，选取继代培养生长良好的愈伤组织，将其切成均匀小块，接入分化培养基中培养分化出芽，培养时间为20?30 d ;
4.微球茎的诱导
4.1组培芽的接入
当芽长到有1?3 cm长时，选取生长良好的芽，从愈伤组织处切下，使其带有一小块愈伤组织，愈伤组织直径3± 1 mm，接入到6-糖基氨基嘌呤6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.8mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.8 mg/L、糖质量百分浓度为3 %诱导培养基中，诱导培养基为基本培养基为改良后的MS培养基，肌醇浓度提高到500 mg/L，将愈伤组织插入诱导培养基中，而芽留在培养基外面，放入光照条件12 h/d，光照时间为12 h/d，温度为25°C的培养室中培养；
4.2微球茎的形成
将带有愈伤组织的幼芽接入到诱导培养基中后，在前10 d愈伤组织继续增大，幼芽也迅速增长，在10?20 d中从愈伤组织上不断长出不定根，且愈伤组织不在增殖，表面变得平滑，有绿色的亮泽出现，在20?30 d中植株不断成熟，同时，愈伤组织完全变成与半夏块茎外形、结构相似的幼小球茎；
5.半夏试管微球茎采收及贮藏
将诱导出与半夏块茎外形相似的幼小球茎从培养基中取出洗净，将微球茎以上的半夏苗切除，保留球茎部分，并将获取的半夏微球放入到质量浓度为0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5-8min，然后放入到活性炭:滑石粉:多菌灵质量比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.1 mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.lmg/L、赤霉素GA3浓度为0.lmg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤2次后放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5-7min取出置于空气中固化10_15min，再将已固化的半夏微球放入0.4%氯化钙溶液中侵泡l_2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装、贮藏，亦可直接用于大田生产。
【主权项】
1.一种试管微球茎的制备方法，其特征在于包括如下操作步骤: 1).将半夏块茎接入培养基中诱导出愈伤组织后，进行继代增殖、芽的分化； 2).当经过诱导出的半夏组培芽长到有1?3cm长时，选取生长良好的芽，从愈伤组织处切下，使其带有一块愈伤组织，愈伤组织直径3±1 _，将半夏组培芽接入到诱导培养基中，芽留在培养基外面，诱导培养基的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.8 mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.8 mg/L、糖浓度为3 %，诱导培养基的肌醇浓度提高到500 mg/L，放入光照条件.12 h/d，光照时间为12 h/d，温度为23— 27°C左右的培养室中培养； 3).将带有愈伤组织的幼芽接入到培养基中后，在前10d愈伤组织继续增大，幼芽也迅速增长，在10—20 d中从愈伤组织上不断长出不定根，且愈伤组织不在增殖，表面变得平滑，有绿色的亮泽出现，在20— 30 d中植株不断成熟，同时，愈伤组织完全变成与半夏块茎外形、结构相似的幼小球茎； 4)、将诱导出与半夏块茎外形相似的幼小球茎从培养基中取出洗净，将微球茎以上的半夏苗切除，保留球茎部分，并将获取的半夏微球放入到质量浓度为0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5 — 8min，然后放入到活性炭:滑石粉:多菌灵比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为0.1 mg/L、萘乙酸NAA浓度为0.lmg/L、赤霉素GA3浓度为0.lmg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤2操作，放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5 — 7min取出置于空气中固化10_15min，再将已固化的半夏微球放入0.4%氯化钙溶液中侵泡l_2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装、贮藏。
【专利摘要】本发明公开了一种高效生产半夏试管微球茎的方法，本发明中半夏试管微球茎是指在组织培养条件下，以半夏块茎经过诱导出愈伤组织，脱去主要病毒，再用愈伤组织诱导出半夏组培芽，在通过控制培养基成分和培养条件及环境温度，诱导试管苗形成微球茎。该方法繁殖速度快，生产效率高，生产成本低，能周年工厂化生产；生产出来的试管微球茎具有无病毒、体积小、贮藏运输方便特点，是一项具有产业前景，能从根本上解决半夏退化的先进方法。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105379619
【申请号】CN201510692933
【发明人】候锋, 李林丽
【申请人】施秉县丽康生态农业科技发展有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月24日