一种玉米品种抗粗缩病人工接种鉴定方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及玉米品种对玉米粗缩病抗性的室内接种鉴定方法及其在农业上的应 用，属于农业科学技术领域。
【背景技术】：
[0002] 玉米粗缩病是严重危害玉米的一种爆发流行性病毒病害，由水稻黑条矮缩病毒 (Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV)引起。20世纪70年代和90年代曾在我国大 范围长时间的流行，至今已扩展到河北、陕西、山东、江苏、湖北、辽宁等10余省市，该病流 行时常造成严重减产。近年来，随着气候环境变化和种植结构调整，全国（尤其是黄淮海地 区）玉米粗缩病的发生呈明显上升趋势，2004年玉米粗缩病在江苏省爆发，造成大幅度减 产，2008年山东省发病面积达73. 3万hm2。目前，粗缩病已经成为我国主要玉米病害之一， 对玉米生产构成严重威胁。
[0003]目前玉米生产上尚无抗粗缩病病品种应用，一旦气候条件适宜很容易爆发流行， 选育抗病品种防治玉米粗缩病的进程刻不容缓。研究者主要采用田间自然传毒鉴定和人工 接种鉴定进行玉米粗缩病的品种抗性鉴定。田间鉴定易受环境条件、灰飞虱种群发生及迀 飞数量等因素的影响，鉴定的准确性较差，使选育抗病品种往往需多年多地重复鉴定，这使 得玉米粗缩病的抗性品种选育工作受到极大的限制，迫切需要发明一种玉米粗缩病的室内 接种鉴定方法，既可以模拟田间的抗性鉴定效果，又可以提高延长鉴定时间，为玉米抗粗缩 病的资源发掘筛选、品种选育和遗传规律研究提供基本的研究手段。
【发明内容】
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[0004] 本发明提供了一种玉米粗缩病品种抗性的室内接种鉴定方法。
[0005] 本发明的原理是：采集携带水稻黑条矮缩病毒的小麦绿矮病株饲喂灰飞虱使之获 病并渡过病毒的循回期后获得接种体，再以一定数量的接种体在玉米特定生育期接种待测 玉米一定时间，培养待测玉米至发病显症后，根据病害发生的严重度评价待测玉米对玉米 粗缩病的抗性水平。
[0006] 在上述方法中，"一定数量的接种体"是指有效接种虫量1-3头/株，其中，有效接 种虫量=接种虫量X带毒率；"玉米特定生育期"是指玉米芽鞘期-4叶1心期；"接种待测 玉米一定时间"是指接种玉米12-48小时。
[0007] 所述用于饲毒的灰飞虱为1-3龄，饲毒时间为2-3天，饲毒后的循回期为10天以 上（可根据操作需要、环境温度和带毒植株的差异进行选择）。
[0008] 本发明提供了一种玉米粗缩病抗性的室内接种鉴定方法，利用其评价玉米品种对 玉米粗缩病的抗性水平，可以拓宽品种抗性鉴定时间。这一鉴定方法可以应用于玉米品种 资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
【具体实施方式】：
[0009] 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0010] 实施例1，玉米品种对玉米粗缩病抗性的室内接种鉴定方法
[0011] ①携带水稻黑条矮缩病毒的小麦绿矮病株的获得。
[0012] 2013年4月于江苏建湖重病区采集植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增多，心叶有缺 刻等表现出小麦绿矮病典型症状的新鲜小麦植株。参照Trizol(Reagent)说明书方法提取 小麦总RNA。根据已发表的RBSDV的S9序列设计引物（引物由上海英俊生物技术公司合 成）：
[0013]R: 5，-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3,
[0014]F1 :5，-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3，。
[0015] 米用RT-PCR检测确定病株是否携带水稻黑条矮缩病毒。反转录按照M-MLV反转 录酶（Promega)说明书进行。PCR扩增体系为：cDNA模板3. 0L，Taqplus酶0. 5L，dNTP(每 份10謹〇1丄-1)0.51^，10\?0?缓冲液（含]\%2+)2.51^5'端引物（1(^111〇1丄-1)1.01^3'端 引物（lOpmol.L-l) 1. 0L，ddH20 16. 5L，合计 25L。反应程序为：95°C预变性 5min;94°C变性 lmin;51°C退火lmin;72°C延伸lmin;35个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存，1%琼脂糖 凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带（1118bp)。
[0016] 挑选出6株含有水稻黑条矮缩病毒的小麦植株备用。
[0017] ②小麦绿矮病植株为毒源饲喂灰飞虱
[0018] 本室常年饲养无毒灰飞虱群体。将筛选得到的新鲜小麦病株种于1000mL烧杯中， 土面覆盖滤纸，将适量1-2龄无毒灰飞虱若虫移入其中，并用纱布封口，饲喂48h后将其移 入预先育有武育粳3号健康秧苗的1000mL烧杯中过循回期（10-12d)，循回期过后取100头 灰飞虱Dot-ELISA法检测其RBSDV带毒率。
[0019] ③接种强度对抗性鉴定的影响
[0020] 接种强度按有效接种虫量（根据②中测定的灰飞虱带毒率换算，有效接种虫量= 接种虫量X带毒率）设置1、2、3头/株3个处理，重复3次。将感病品种苏951播于500ml 烧杯中，每杯播种4株苗。待秧苗长至2叶1心时进行接种鉴定（接种前2d淘汰病弱苗，挑 选生长一致的幼苗25-30株用于接种鉴定）。接入灰飞虱后每天赶虫2次以确保被测玉米 均匀获毒，接种2天后移走灰飞虱，将被测玉米移栽至大田，正常水肥管理。30天后开始病 害调查，每7天调查一次，连续调查3次。症状主要表现为植株矮化，叶色浓绿，叶片僵直、 宽短而厚，心叶不能正常展开，叶片背部叶脉上产生蜡白色隆起条纹，用手触摸有明显粗糙 感。不同接种强度下玉米品种苏951的发病情况如表1。随着接虫强度的增加，苏951的发 病率也不断提高，有效接种强度为1头/株、2头/株2种处理间没有明显区别，但都显著低 于3头/株处理。
[0021] 表1不同接种强度下玉米品种苏951的发病情况表
[0022]
[0023] ④玉米接种苗龄对抗性鉴定的影响
[0024] 接种苗龄设置芽鞘期、2叶1心、4叶1心期3个处理，重复3次。接种强度为有效 接种虫量2头/株，接种及调查方法同上。不同玉米接种龄期对玉米粗缩病抗性鉴定的影 响如表2。当水稻接种龄期处于4叶1心期之内时，苏951的发病率间不存在显著性差异， 这表明水稻黑条矮缩病室内接种鉴定适宜的接种龄期应该为芽鞘期-4叶1心期。
[0025] 表2不同玉米接种龄期对玉米粗缩病抗性鉴定的影响
[0026]
[0027] ⑤接种时间对抗性鉴定的影响
[0028] 接种时间设置6h、12h、24h和48h4个处理，重复3次。接种强度为有效接种虫量 2头/株，接种苗龄为2叶1心，接种及调查方法同上。不同接种时间对玉米粗缩病抗性鉴 定的影响如表3。随接虫时间的增加感病品种的发病率亦不断提高。接种12h、24h和48h 苏951的发病率显著高于另外1种处理，这表明玉米粗缩病室内接种鉴定适宜的接种时间 应该为12-48h。
[0029] 表3不同接种时间对玉米粗缩病抗性鉴定的影响
[0030]
[0031] 本发明主要服务于针对玉米粗缩病开展的抗性资源筛选发掘、抗病品种的鉴定与 评价和抗性品种的选育。同时该项技术还可在植物抗病性的遗传学和抗水稻黑条矮缩病毒 转基因的研究工作中作为生物学检测方法应用，将能够大大加快研究的进程。
[0032] 实施例2,人工接种鉴定与重病区田间鉴定效果的比较
[0033] 选择大丰稻麦原种场和丰县欢口镇沙庄村重病区作为鉴定圃，两地分别于2012 年5月下旬和2014年6月上旬播种玉米品种苏951。大丰稻麦原种场和丰县欢口镇沙庄 村1代灰飞虱成虫峰期总虫量分别为8. 69X105虫/亩和2. 60X10 5虫/亩，带毒率分别为 2%和3%，其有效接种虫量分别为1. 74X104虫/亩和7. 80X10 3/亩。以4500株/亩折 算，其有效接种虫量分别为3. 86虫/苗和1. 73虫/苗。于田间第1次发病高峰期调查发 病情况，7天重复调查1次，计算发病率。人工接种鉴定与田间鉴定结果见表4。玉米品种 苏951的人工接种鉴定与重病区田间鉴定结果间无显著差异，说明本研究建立的人工接种 鉴定方法能够模拟重病区田间鉴定效果，其抗性评价结果可靠。
[0034] 表4人工接种鉴定与田间鉴定结果
[0035]
[0036] 上述实施不以任何形式限定本发明。
【主权项】
1. 一种玉米品种对玉米粗缩病抗性的人工接种鉴定方法，其特征在于：在室内条件下 以一定数量的接种体在玉米特定生育期接种待测玉米一定时间，培养待测玉米至发病显症 后，根据病害发生的严重度评价待测玉米对玉米粗缩病的抗性水平。 2. 1中所述"一定数量的接种体"是指有效接种虫量1-3头/株；"玉米特定生育期"是 指玉米芽鞘期-4叶1心期；"接种待测玉米一定时间"是指接种玉米12-48小时。
【专利摘要】本发明提供了一种玉米粗缩病品种抗性的人工接种鉴定方法。本发明的原理是在室内条件下以一定数量的接种体在玉米特定生育期接种待测玉米一定时间，培养待测玉米至发病显症后，根据病害发生的严重度评价待测玉米对玉米粗缩病的抗性水平。利用本方法评价玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平，既可以克服田间鉴定结果的不稳定性，又可以拓宽品种抗性鉴定时间。这一鉴定方法可以应用于玉米品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
【IPC分类】A01K67/033, A01G7/06
【公开号】CN105393815
【申请号】CN201510716668
【发明人】周彤, 杜琳琳, 周益军, 曹晓燕, 吕建颖, 饶鸣帅, 王喜, 兰莹, 孙枫
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月26日