一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种肠道病毒的小分子化合物 抑制剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒，颗粒小，呈20面体，直径24~30nm，不含类脂体，核心有单链核糖核 酸，耐乙醚和其它脂溶剂，耐酸，对各种抗生素、抗病毒药、去污剂有抵抗作用。多数病毒 在细胞培养中产生细胞病变。属于小RNA病毒科，为裸露病毒，不同肠道病毒可引起相同的 症状，同一种病毒可引起不同临床表现。肠道病毒多见隐性感染，可引起轻微上感、腹部不 适和腹泻等症状。偶尔侵犯中枢神经系统，引起弛缓型麻痹。
[0003] 肠道病毒71型（EV71)和柯萨奇病毒A16(CVA16)是引起亚太地区婴幼儿手足口 病的主要病原体。从2008年1月到2013年12月间，仅中国大陆地区就有九百多万的儿童 被确诊为手足口病，并有2700多的死亡病例。手足口病的常见症状包括发热，局部出疹等， 但也有些病人会发展成中枢神经系统（CNS)疾病，如无菌性脑膜炎，致死性脑炎。EV71是 引起重症手足口病的主要病原体（Huangetal.，1999;Komatsuetal.，1999;McMinnet al.，2001)。手足口病目前仍然是非常严峻的公共卫生问题，但迄今为止尚无有效的预防措 施及治疗方法，因此寻找抗病毒药物迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用。
[0005] 本发明的第一方面，提供了伊曲康唑、和/或伊曲康唑类似物或其药学上可接受 的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于
[0006] ⑴抑制RNA的合成；和/或
[0007] (ii)抑制病毒的生长或繁殖；和/或
[0008] (iii)抑制病毒的3A蛋白的活性。
[0009] 在另一优选例中，所述RNA选自：病毒RNA、原核细胞RNA和真核细胞RNA。
[0010] 在另一优选例中，所述病毒为RNA病毒，优选地，所述RNA病毒为肠道病毒。
[0011] 在另一优选例中，所述药物还用于治疗或预防肠道病毒感染引起的疾病。
[0012] 在另一优选例中，所述肠道病毒感染引起的疾病包括但不限于由肠道病毒感染引 起的：手足口病、无菌性脑膜炎、脑膜炎、脊髓灰质炎、急性呼吸道疾病、急性心肌炎、新生儿 多器官衰竭和急性弛缓性麻痹。
[0013] 在另一优选例中，所述伊曲康唑类似物选自下组：泊沙康唑、美国专利申请公开号 US4267179A中描述的伊曲康唑类似物。
[0014] 在另一优选例中，所述伊曲康唑的结构如式I所示，
[0015]
[0016] 在另一优选例中，所述泊沙康唑的结构如式II所示，
[0017]
[0018] 在另一优选例中，所述肠道病毒包括：人肠道病毒A、人肠道病毒B、人肠道病毒C、 和/或人肠道病毒D。
[0019] 在另一优选例中，所述新型肠道病毒包括：人肠道病毒EV71型、CVA16型、CVB3型、 PV1型或EV68型。
[0020] 在另一优选例中，所述药物包括口服制剂。
[0021] 本发明的第二方面，提供了一种肠道病毒的抑制剂，所述抑制剂通过抑制肠道病 毒的RNA合成和/或通过抑制病毒3A蛋白的活性来抑制所述肠道病毒的生长或繁殖；优选 地，所述抑制剂选自下组中的一种或多种：
[0022] (1)伊曲康唑；和/或
[0023] (2)伊曲康唑类似物。
[0024] 本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第二 方面所述的抑制剂或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
[0025] 在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：口服制剂。
[0026] 本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道 病毒的方法，包括步骤：在需要处理的场所施用本发明第二方面所述的抑制剂或其药学上 可接受的盐。
[0027] 在另一优选例中，所述方法中，所述伊曲康唑或伊曲康唑类似物的施用浓度为 彡ΙμΜ，优选地，彡ΙΟμΜ;可以为 5μΜ,ΙΟμΜ, 15μΜ,20μΜ,50μΜ〇
[0028] 本发明的第五方面，提供了一种复合物，所述复合物如式III所示
[0029]A-BIII
[0030] 其中，A为伊曲康唑或其类似物；B为肠道病毒的3A蛋白。
[0031] 本发明的第六方面，提供了一种筛选药物的方法，所述方法包括：将待筛选药物与 肠道病毒或者肠道病毒的3A蛋白接触，并检测是否形成本发明第五方面所述的所述的复 合物。
[0032] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0033] 图1.伊曲康唑和泊沙康唑抑制EV71的感染。图1A显示了RD细胞中加入3倍倍比 稀释的伊曲康唑，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力， 检测伊曲康唑对EV71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用GraphpadPrism5进行处理。 图1B显示了用感染复数（Multipleofinfections,Μ0Ι)为0.1的EV71感染RD细胞，并且 加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，培养42h后收集上清液，用空斑形成实验测定病毒滴度。图 中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。图1C显示了RD细 胞中加入3倍倍比稀释的泊沙康唑，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试 剂盒检测细胞活力，检测泊沙康唑对EV71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用Graphpad Prism5进行处理。图ID显示了氟康唑对EV71病毒的抑制活性。图1E显示了伏立康唑对 EV71病毒的抑制活性。
[0034] 图2.伊曲康唑的抗病毒谱研究。图2A显示了分别用EV71SH036株（Μ0Ι= 0. 1)， CVA16 (Μ0Ι= 0· 01)，CVB3 (Μ0Ι= 0· 001)，PV1 (Μ0Ι= 0· 01)，EV68 (Μ0Ι= 0· 1)感染RD细 胞，并加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，分别在感染48、42、24、42、48h后收集上清液，测定病 毒的滴度。图2B显示了用GraphpadPrism处理数据，计算得出伊曲康唑抑制病毒的EC5。。
[0035] 图3.伊曲康唑抑制病毒的机制研究。图3A显示了不同时点加药实验。Μ0Ι为5的 EV71在4°C感染Vero细胞lh，用预冷的培养基洗三遍，然后在相应的时间点加入5μΜ的伊 曲康唑，20h后收集上清液测病毒滴度。对照组是在感染0、10、16h时加入0. 25%DMS0。图 3B显示了瞬时复制子实验。lyg含萤火虫荧光素酶报告基因（F-Luc)的复制子转染BHK-21 细胞，转染后的细胞接种到12孔板中，分别加入5μΜ的伊曲康唑，0. 25%DMS0 (对照），并 在lh、16h收集裂解液进行检测。加药组与对照组的荧光酶活性通过two-wayAN0VA进行 比较（***ρ〈〇· 001)。
[0036] 图4.伊曲康唑通过抑制病毒3Α蛋白的合成来发挥抗病毒活性。图4Α显示了伊 曲康唑耐药株的筛选方案。图4Β显示了 3株耐药株的耐药性比较。图4C显示了 3株耐药 株抑制倍数与野生型比较。
【具体实施方式】
[0037] 本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现了伊曲康唑及其类似物对肠道病毒 的抑制活性，实验结果表明，伊曲康唑及其类似物对多种肠道病毒均有良好的抑制作用。在 此基础上完成了本发明。
[0038] 肠道病毒
[0039] 肠道病毒（enterovirus)在分类上属于小核糖核酸（RNA)病毒科 (picomaviridae)，人肠道病毒至少由100个血清型组成，其代表性的种类包括（但并不限 于）：
[0040] 人肠道病毒A，包括21种血清型：柯萨奇病毒coxsackievirusA2 (CV-A2)，CV-A3, CV-A4,CV-A5,CV-A6,CV-A7,CV-A8,CV-A10,CV-A12,CV-A14,CV-A16,肠道病毒enterovirus A71(EV-A71),EV-A76,EV-A89,EV-A90,EV-A91,EV-A92,EV-A114,EV-A119,EV-A120,EV- A121 ；
[0041] 人肠道病毒B，包括 59 种血清型：coxsackievirusB1(CV-B1)，CV-B2，CV-B3，CV-B 4,CV_B5(incl.swinevesiculardiseasevirus[SVDV])，CV-B6，CV_A9，埃可病毒echovir usl(E-l)，E-2,E-3,E-4,E-5,E-6,E-7,E-9 (包括CV-A23)，E-ll,E-12,E-13,E-14,E-15,E-l 6,E-17,E-18,E-19,E-20,E-21,E-24,E-25,E-26,E-27,E-29,E-30,E-31,E-32,E-33,enter ovirusB69(EV-B69)，EV-B73,EV-B74,EV-B75,EV-B77,EV-B78,EV-B79,EV-B80,EV-B81，EV -B82,EV-B83,EV-B84,EV-B85,EV-B86,EV-B87,EV-B88,EV-B93,EV-B97,EV-B98,EV-B100,E V-B101,EV-B106,EV-B107,EV-B111 ；
[0042] 人肠道病毒C，包括23种血清型：人脊髓灰质炎病毒？〇1丨〇￥化1^(?￥)1，？￥-2，卩￥-3,coxsackievirusA1(CV-A1)，CV-A11，CV-A13,CV-A17,CV-A19,CV-A20,CV-A21，CV-A22,C V-A24,EV-C95,EV-C96,EV-C99,EV-C102,EV-C104,EV-C105,EV-C109,EV-C113,EV-C116,EV -C117andEV-C118 ;
[0043] 人肠道病毒D，包括 4 种血清型：EV-D68,EV-D70,EV-D94,EV-D111。
[0044] 肠道病毒感染的临床表现多样，除无症状感染外，还有广泛的急性疾病，包括急性 呼吸道疾病、无菌性脑