一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物器官组织培养，特别是药用植物不定根培养基。
【背景技术】
[0002] 金铁锁（卩8&11111108；[16116 1：1111；[(301(168?.0.￥1161：(].￥.￥11)为石竹科 (Caryophy Ilaceae)金铁锁属(Psammosi Iene)单种属多年生药用草本植物，又名昆明沙参、 独定子等。金铁锁根含皂苷成分，并含氨基酸、有机酸、三萜等，其根干燥后入药，是云南白 药、雪上一枝蒿、痛血康胶囊、金骨莲胶囊等的主要成分。我国缺乏中药资源有效保护措施， 野生资源濒临灭绝，以人工培养和产业化生产可弥补植物资源的匮乏。金铁锁不定根的培 养主要受外植体、接种量、植物激素、蔗糖以及无机盐等几方面的影响。相关报道中，赵爽和 李景滨曾分别利用发根农杆菌金铁锁获得毛状根，并研究金铁锁毛状根的最优培养条件。 但该技术需要较高技术和设备条件，尚有局限。（赵爽等.金铁锁毛状根诱导的初步研究 [J].中药材，2012,35(2) :176-179;李景滨等.金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立[J]. 中国中药杂志，2011，36(5): 547-551)。文献："影响金铁锁毛状根生长及皂苷积累的因 素"是以发根农杆菌ACCC10060菌株感染金铁锁茎段、叶片诱导出毛状根，经抗卡那霉素筛 选培养，获得的毛状根为不定根液体培养材料，分别接种5种添加了外源激素的液体培养基 中，以添加 NAA、IAA、IBA的1/2MS液体培养基对金铁锁不定根增殖较好，且发现增长率与皂 苷产量呈正相关。（田思迪等，时珍国医国药[】]，2012,23(4):824-826.)。另一文献："不同 培养条件对金铁锁毛状根生长的影响"（高帅，王洪峰，侯丽丽，等，广东林业科技[J]， 2012，28(2): 16-21.)选择1/2MS固体培养基为最佳培养基，以发根农杆菌侵染后的不定根 为材料进行培养。
[0003] 糖是外植体生长发育形成碳架的元素，同时维持培养基的渗透压。不同种类的糖， 分子结构不同，其形式与浓度对不定根生长影响较为明显。以上两篇文献认为蔗糖作为培 养基的碳源，金铁锁毛状根生物量积累最大。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在建立一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法，它包括由基本培养基及 其与不同种类激素组合构成的培养基体系，以便于根据生产实际选择相应的培养基进行生 产，从而降低生产成本，提高效率，为工厂化生产金铁锁不定根提供指导。
[0005] 本发明以下述方法实现： (1) 切取金铁锁无菌苗的顶芽接种于l/2MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA+ 0.3g/L活性 炭的生根培养基中，于60d后形成毛状不定根丛； (2) 按块状方式切取扩繁后的金铁锁不定根丛，接种于添加了激素和白砂糖的MS固体 基本培养基中，每瓶分装25mL的培养基，每瓶接种4块金铁锁不定根丛。
[0006] 进一步，所述的培养基为以下之一种： (I)MS固体基本培养基与生长素的组合:MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L IBA; (2)MS固体基本培养基与细胞分裂素的组合:MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L KT; 以上（1)~(2)培养条件为：25±2°C，光照时间12 h/d，光照强度1500~2000 lx，培养 时间40d。
[0007] 优选的，所述的培养基为MS固体基本培养基与细胞分裂素的组合:MS+1.0 mg/L KTo
[0008] 进一步，所述的培养基是:接种于所述的培养基的金铁锁不定根组织块为0.05g/ 块，该组织块干重约合0.0056 ± 0.0004g/块。
[0009] 本发明的显著进步在于： (1)本发明通过2种不同组成成分的培养基培养结果认为:除考虑所选材料的基因型不 同外，应当以MS固体培养基为金铁锁毛状根的基本培养基，在该基本培养基下，即使不添加 激素其鲜重也可以达到较高数值，这与目前一般选择1/2MS培养基不同。
[0010] (2)与现有技术取蔗糖和葡萄糖不同，本发明从不定根生长效果和生产成本考虑： 在MS培养基中加入30 g/L的白砂糖更适宜于金铁锁不定根的生长和生物量积累。在30 g/L 的白砂糖下，不添加激素其鲜重可达到5.088 g的较高数值，其干重为0.480g，也是较高数 值。它反映出：白砂糖作为培养基的补充碳源，以30 g/L的用量，既能有效降低成本，又能获 得较高的毛状根产出。
[0011] (3)本发明在添加了30g/L白砂糖的MS基本培养基中附加1.0 mg/L IBA培养金铁 锁不定根，也可获得较好的效果。
[0012] (4)评价金铁锁不定根生长情况的指标包括鲜重、干重的生长量及干物率。其中， 干物率是指不定根的干重与鲜重的比值，它反映了不定根的净得率。在添加了 30g/L白砂糖 的MS固体培养基上，本发明改变了金铁锁组织培养的植物激素，在添加1.0 mg/L KT的MS培 养基中不定根干重和干物率最高，且与其他处理差异显著，KT更有利于金铁锁不定根的生 长。相对于现有文献的数据，该MS+1.0 mg/L KT的固体培养基所获得的金铁锁不定根的干 物率为11.96%，其鲜重为173.2 g.L-S干重为20.72 g.L-S干重是现有文献的1.52倍。
【附图说明】
[0013] 图1为WPM基本培养基中不定根生长情况。
[0014] 图2为MS基本培养基中不定根生长情况。
[0015] 图3为MS+30 g/L白砂糖的培养基中不定根生长情况。
[0016] 图4为MS+IBA 1.0 mg/L培养基中不定根生长情况。
[0017] 图5为MS+KT 1.0 mg/L培养基中不定根生长情况。
[0018] 图6为MS+ NAA 0.5 mg/L +KT 0.5 mg/L培养基中不定根生长情况。
[0019]以上MS是指MS固体培养基，KT是指激动素，IBA是指3-吲哚丁酸，NAA是指α-萘乙 酸。
[0020]以下结合实施例对本发明做进一步说明。本发明包括但不限于实施例的内容。
【具体实施方式】
[0021 ] 1材料与方法 1.1材料 在无菌条件下，切取金铁锁无菌苗的顶芽接种于l/2MS+0.3mg/L IBA+O.lmg/L NAA+ 〇. 3g/L活性炭的生根培养基中生根培养，于60天后，培养成毛状不定根丛，备用。
[0022] 1.2 方法 接种时，按块状方式切取上述不定根丛进行培养。
[0023] 1.2.1不同基本培养基对金铁锁不定根生物量的影响 切取金铁锁不定根组织块，每块约〇. 〇5g，干重约合0.0056 ± 0.0004g/块，分别接种于 分别添加了30 g/L蔗糖的MS、1/2MS、WPM三种固体基本培养基中，每处理5瓶，每瓶分装25mL 培养基，每瓶接种4块，重复3次，于第40d时测定金铁锁不定根的鲜重、干重。培养条件为： 温度25±2°C，光照时间12 h/d，光照强度1500~2000 lx。下同。
[0024] 1.2.2不同浓度碳源种类对金铁锁不定根生物量的影响 切取金铁锁不定根组织块，每块约〇. 〇5g，干重约合0.0056 ± 0.0004g/块，分别接种于 不同碳源的基本培养基上。该培养基分别加入浓度为20、30及40 g/L的白砂糖、蔗糖和葡萄 糖，试验共计9种处理，每处理5瓶，每瓶分装25mL培养基，每瓶接4块，重复3次，于第40 d时 测定金铁锁不定根的鲜重、干重。
[0025] 1.2.3不同浓度生长素对金铁锁不定根生物量的影响 基于1.2.1和1.2.2筛选得到的基本培养基和碳源，附加不同浓度的IBA和NAA作为附加 了生长素的培养基。
[0026] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，其干重约合0.0056 ± 0.0004g/块，分别 接种于附加了生长素的培养基上。试验共计9种培养基处理。每处理5瓶，每瓶分装25mL培养 基，每瓶接4块，重复数为3，于第40 d时测定金铁锁不定根的鲜重及干重。
[0027] 1.2.4不同浓度细胞分裂素对金铁锁不定根生物量的影响 基于1.2.1和1.2.2筛选得到的基本培养基和碳源，附加不同浓度的KT、6-BA和TDZ作为 附加了细胞分裂素的培养基。
[0028] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，其干重约合0.0056 ± 0.0004g/块，分别 接种于附加了细胞分裂素的培养基上。试验共计11种培养基处理，每处理5瓶，每瓶分装 25mL培养基，每瓶接4块，重复数为3，于第4