一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物农药与微生物肥料技术领域，具体涉及一种含芽孢萌发剂的枯草 芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国每年使用大量的化学农药制剂与化肥，极易造成农药残留超标，生物富集，不 仅污染生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小，对人无害，是一种具有广阔前 景的绿色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
[0003] 芽胞杆菌是目前生物农药与微生物肥料中研究最多的一种微生物，它具有广谱抗 菌活性和极强的抗逆能力，其营养细胞能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病 菌生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面显示出了广阔的应用 前景。
[0004] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生 理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染 环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可 以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在 植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示 出很好的病害防治效果。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞 争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌 入侵，从而达到生防的目的。其主要防治对象为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病 (Stagonospora curt i s i i )、小麦纹枯病（Rhi zoctonia cereal i s )、番前叶霉病 (Cladosporium fulvum)、豆类根腐病（Fusariurn graminerarum) (Rhizoctonia spp·)、苹 果霉心病(Alternaria alternata)、棉花立枯病（Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病 (Fusariurn oxysporum f.sp.vasinfectum)等。
[0005]国外最早有关枯草芽孢杆菌有防治植物病害作用的报道见于1945年Johnson等人 的研究，此后有关枯草芽孢杆菌的生物防治研究成为了热点，不断有人研究报道枯草芽孢 杆菌的生物防治作用，并且已经有产品推向市场。到目前为止，枯草芽孢杆菌的生物防治研 究依然是一个热点。
[0006] 目前，各国都已经有有关枯草芽孢杆菌菌剂的报道。如澳大利亚报道的Bacillus subtilis A-B对小麦和胡萝卜的立枯病和其他土传病害有防治作用。日本东京技术研究所 的Bacillus subtilis RB14对引起番前病害的立枯丝核菌和尖孢镰刀菌有生防作用，另外 一种BaciUus subtilis NB22对靑枯假单胞菌引起的番游病害有很好的防效作用。
[0007] 到目前为止，不断有新的研究报道枯草芽孢杆菌对新的农作物的生防作用。 A.Holzinger等人筛选出一株Bacillus subtilis 3A25,对芥菜叶绿素的含量、幼苗的高 度、根的长度和叶片面积都有显著的促生作用。该菌种的菌剂不管是在叶片施喷还是土壤 施喷都显著减少了大棚内臭氧反应的副作用。Tesfagiorgis Demoz等人发现枯草芽孢杆 菌能够防治轉梨的蒂腐病，在鳄梨开花的时候施喷液体剂型，枯草芽孢杆菌能够有效地吸 附和存活在花朵上，分泌的拮抗物质能够造成病原菌的分生孢子和菌丝的降解，从而达到 防治鳄梨蒂腐病的目的。K.c. ICuppera等研究发现Bacillus subtilis ACB-69能够防治 由炭疽病菌造成的柑橘花后落果病，当每周喷洒用药(活菌数为5 X 108cfu/mL) -次能够 将花朵患病的概率降低47%，而对照组的化学试剂只降低了 18%，在整个开花阶段都喷洒施 用能够使甜橙结出更多的果实。M.R. Swain从牛粪中分离得到一株枯草芽孢杆菌，对于尖 孢镰刀菌的抑制率为25-34%，对于黑腐病菌的抑制率为100%，此外，该枯草芽孢杆菌还能够 将硫氧化为硫酸盐，具有溶磷作用。
[0008] 枯草芽孢杆菌的菌剂不仅可以直接通过喷洒、埋植等传统方式来实施，而且也可 以通过寻找动物等载体来起到生物防治的作用。蓝莓作为美国第二大水果，花朵的传粉好 坏直接影响到蓝莓产量，所以农户必须得人工饲养蜜蜂来帮助蓝萄传递花粉，但是在蜜蜂 传递花粉的过程中会把链核盘菌这种病原菌也带到花朵上，从而使花朵枯萎，产量减少。 Sel imDedej等人发现一株枯草芽孢杆菌对链核盘菌有高度的拮抗作用，在蜂箱出入口放入 枯草芽孢杆菌菌剂，使每个蜜蜂可以携带5.1-6.4 X IO5Cfu枯草芽孢杆菌，传递到每个花朵 上的菌数〈1〇3 cfu个，从而使得花朵的枯萎病得到了很好的抑制。
[0009] 国内有关枯草芽孢杆菌生防菌的研究虽然起步较国外晚，但是发展非常快，在枯 草芽孢杆菌生物防治方面已经取得了很大的成就，无论是生防菌种资源还是能够抑制的病 原微生物种类都达到了国际水平。目前，己经有多种枯草芽孢杆菌菌剂上市，上市产品如南 京农业大学的麦丰灵，云南星耀制品厂的百抗，光华化工股份公司的台湾宝，香港经纶全汛 有限公司的亚宝，江苏农业科学院的纹曲宁等，对水稻纹枯病，稻瘟病，烟草，花卉，小麦，白 菜等的土传病害与叶部病害能进行有效的防治。
[0010] 除上述已经上市的枯草芽孢杆菌产品以外，不断有人报道新的枯草芽孢杆菌菌种 对不同植物病原菌的生防作用。Li Hui等从小麦根部分离到的内生Bacillus subtilis ElR-j对小麦柄诱病、葡萄白腐病和菌核病有较好的生防作用，在大田实验中，ElR-j的发酵 液对小麦柄锈病的防效达到51%，而且较对照组有增产作用，ElR-j发酵液的10倍稀释液对 孢子萌发的抑制率为84. nZhong Wei等从番痴根际土壤中分离到的BaciIlus subtilis QL-5和QL-8对细菌性枯萎病有生防作用，混合使用效果会更好。连玲丽等人用植物盆栽法 研究发现，Bacillus Pumilus EN16能诱导番節对青枯病的防病效果达到49.45% -68.89%， 采用菌液灌根处理有较好的抗病效果。庄敬华等人通过室内拮抗试验和温室盆栽试验发 现，Bacillus subtilis B6的代谢物对甜瓜枯萎病原菌孢子萌发和菌丝生长都有抑制作 用，B6代谢物处理后病情指数由37.65降至11.29。刘勇等人的研究表明，枯草芽孢杆菌菌剂 BS2004可以显著降低因姜痕导致的生姜死亡率，并增产51.2%;对大白菜根肿病的防病效果 达到52.3%，增产14.7%，对莴苣霜霉病的防效达到69.0%。张晓云等人采用叶面喷雾法试验 发现，BaciIlus subtilis CAB-I的抑菌蛋白粗提物对黄瓜白粉病保护和治疗的效果分别 达到73.33%和76.85%，且能降低白粉病原菌分生孢子的萌发率和减少萌发的芽管个数，造 成菌丝顶端呈球状畸形膨大，从而减少新生分生孢子的个数。曹春霞等人的研究显示I.OX 101Qcfu/g的枯草芽孢杆菌WP2.25kg/hm2对草莓白粉病的防治效果达到77.12%，与对照药剂 25%三唑酮WP0.675 kg/hm2处理的防治效果差异不显著。钟啸萍研究发现Baci Ilus subtilis al的代谢产物对油菜菌核病菌和灰霉病菌都有很好的抑制作用。叶云峰等人提 取和纯化了B47的抗菌物质，发现该抗菌物质对14种病原真菌都有拮抗作用，其中对玉米大 小斑病菌和各种香蕉叶斑病菌的拮抗作用较强，0.3 g/L浓度下在田间试验中对玉米小斑 病防治效果为53.05%。黄现青以Baci Ilus subtil is fmbj产生的抗菌物质脂肽进行桃防腐 试验，防腐效果可以达到76.5%。陈莉发现枯草芽孢杆菌的培养液对葡萄灰霉病菌、草莓灰 霉病菌、辣椒灰霉病菌和番庙灰霉病菌有强烈的抑制作用，在菌液浓度达到10 5cfu/mL时， 对4种灰霉病菌的抑制率均达到了 100%。曹春娜用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病 进行田间试验，0.08 g/m2施药后的防效为70.81%，而对照药剂40%啼霉胺0.11 g/m2的防效 为77.40%。田云静用枯草芽孢杆菌菌剂对五味子的白粉病防治效果进行了研究，喷施加灌 施处理五味子后，白粉病的发病率为13.0%，清水对照发病率为37.5%，对二年生、三年生、四 年生五味子的防治效果分别为78.9%、77.8%、75.0%。
[0011] 虽然以芽孢杆菌为主制备的微生物农药产品不少，但目前芽孢杆菌的剂型还是以 可湿性粉剂为主，这种剂型虽然便于储存和运输，但在生产应用中存在很多制约因子。如施 用的可湿性粉剂中大部份以芽孢作为衡量产品中有效成分的惟一标准，若芽孢不能及时萌 发，施用效果则不佳，如王倩利用枯草芽孢杆菌TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用 TR21菌株NB发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的 灌根与叶腋效果却不理想，验证了去掉发酵液后的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下 降。
[0012] 芽孢杆菌在自然界中分布广泛，当外部条件适合生长时，芽胞会由休眠状态经过 一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用，这个过程称为萌发 (germination)。自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被