一种蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物农药与微生物肥料领域，具体涉及一种含有蜡质芽孢萌发剂的蜡 质芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国每年使用大量的化学农药制剂，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染 生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小，对人无害，是一种具有广阔前景的绿 色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
[0003] 芽胞杆菌是目前生物农药与生物肥料中研究最多的一种微生物，它具有广谱抗菌 活性和极强的抗逆能力，其营养细胞能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌 生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面显示出了广阔的应用前 景。
[0004] 蜡质芽孢杆菌是一种在土壤中分离得到的微生物，通过研究发现，不仅能促进番 茄、黄瓜、辣椒，水稻，香蕉等作物的生长，还对番茄青枯病、黄瓜根结线虫病等多种土传病 害具有较好的防效，还可以防治水稻纹枯病，其可以防治蔬菜的根结线虫，山东泰诺药业有 限公司与新沂中凯农用化工有限公司已经申请了农药登记，用于防治姜瘟病，青枯病，枯萎 病等，目前，国内已经有较多生产蜡质芽孢杆菌的产品的技术专利，如郭坚华等在专利号： 201210013022.2公开了一种蜡质芽孢杆菌AR156可湿性粉剂及其制备方法和应用，但其生 产技术方面主要是实验室阶段。张志高等在专利号：2010102268327中公开了一种蜡质芽孢 杆菌悬浮剂的制备及应用技术，主要是防治蔬菜的根结线虫，并没有公开具体的制备技术； 谢绪叶等在专利号:2014105109354中公开了一种含氟酰胺和蜡质芽孢杆菌的杀菌组合物， 主要是协同防治水稻纹枯病;张志高等在专利号：2012102652161中公开了一种蜡质芽孢杆 菌在香蕉上的应用技术，主要是防治香蕉的根结线虫和枯萎病。
[0005] 虽然以芽孢杆菌为主制备的微生物农药产品不少，但目前芽孢杆菌以可湿性粉剂 为主，这种剂型虽然便于储存和运输，但在生产应用中存在很多制约因子。如施用的可湿性 粉剂中大部份以芽孢作为衡量产品中有效成分的惟一标准，若芽孢不能及时萌发，施用效 果则不佳，如王倩利用枯草芽孢杆菌TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用TR21菌株NB 发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的灌根与叶腋 效果却不理想，验证了去掉发酵液后的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。
[0006] 芽孢杆菌在自然界中分布广泛，当外部条件适合生长时，芽孢会由休眠状态经过 一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用，这个过程称为萌发 (germination)。自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为"萌发 剂"，通常营养诱导芽孢萌发包括氨基酸、糖类和嘌吟核苷的单一作用，也包括它们的协同 作用（例如:AGFK; A: L-天冬酞胺;G:葡萄糖;F:果糖;K:钾离子）。当营养物质接触到芽孢 时，芽孢内部会发生一系列变化，（1 )、芽孢核内部H+和Zn2+释放出来，致使芽孢核内部pH由 弱酸性上升至弱碱性；（2)、芽孢核内部Ca 2+--DPA的大量释放；（3)、芽孢核水合，内部Ca2+-- DPA被水所替代，芽孢的耐热性下降；（4)、芽孢皮层的芽孢肤聚糖层水解，芽孢核膨胀；（5)、 芽孢核进一步水合，芽孢核内部蛋白质流动性增强，酶活性加强，合成ATP; (6)、降解SASP蛋 白，以释放芽孢DNA，进而引导芽孢生长过程中RNA、蛋白质、DNA的合成。
[0007] 芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层 到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接 着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。
[0008] 现阶段，还未有在蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂中加入芽孢萌发剂的研究的报道。
[0009] 另外，由于不同的芽孢杆菌与湿润剂，分散剂等助剂的相容性，载体对各类芽孢杆 菌吸附性各不相同，将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺也无法用于制备含芽 孢萌发剂的蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂，可湿性粉剂中有效菌的吸附量，存活率，对有害菌的 防治效果及可湿性粉剂量的稳定性差异较大，其整个可湿性粉剂的制备方法必须全盘考虑 各载体吸附能力，对蜡质芽孢杆菌的干燥过程中保护作用，湿润剂，分散剂对可湿性粉剂的 悬浮率，湿润时间的影响，并且对芽孢萌发剂进行全面的筛选才能够得到湿润时间短，悬浮 率高，芽孢保存时间久，使用后芽孢能快速萌发的，防效好的蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种含有芽孢萌 发剂的蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法，能使蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂融入水后， 蜡质芽孢能快速萌发，大大提高蜡质芽孢的萌发率，制备的蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢 含量为不低于100亿CFU/克，悬浮率不低于78%，润湿时间不高于70S，细度粉碎过400目筛， 水分含量不高于5%，制备方法稳定。
[0011]为了达到上述目的，一种蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂下列重量份组成:蜡质芽孢杆 菌发酵液40-70份；填料：轻质碳酸钙20-30份；润湿剂：茶皂素2-5份；分散剂:Morwet D-4251-3份;芽孢萌发剂:肌苷0.1-0.5份，丝氨酸0.2-1份;紫外保护剂:抗坏血酸1-2份，CMC (羧甲基纤维素)0.5-1份;干燥保护剂:蔗糖5-10份，甘露醇0.5-1份。
[0012] -种蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成： 一、蜡质芽孢杆菌发酵液的制备 取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30°C培养48小时。在平板下挑取单 个菌落接种至50毫升LB培养基中，在培养箱中30°C震荡培养24小时。种子采用5%的接种量， 接种至5L大三角瓶中的蜡质芽孢杆菌液体培养基，装液量为2L，30°C震荡培养16-28小时， 检测其菌液浓度，菌液含量超过30亿/毫升，即可作为蜡质芽孢杆菌种子液。将蜡质芽孢杆 菌种子液接种至1000L的发酵罐中，装液量为600L的发酵培养基，通气量为前16小时为每分 钟液气比为1:0.6，其后通气量为1:1;开搅拌，转速为160r/min，培养温度前24小时为30°C， 其后，每4小时将温度提高1°C，培养28-36小时，检测其芽孢含量超过100亿CFU/ml，即可结 束发酵，作为蜡质芽孢杆菌发酵液； 其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000 mL，pH7.2，固体培养基中 加入琼脂2%; 其中，所述蜡质芽孢杆菌液体培养基:葡萄糖l〇g/L，可溶性淀粉8 g/L，黄豆粉15 g/ U鱼粉5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L， 氯化钙0.5 g/L，pH7.2; 其中，所述的发酵培养基:葡萄糖l〇g/L，玉米粉20 g/L，豆柏粉78 g/L，鱼粉5 g/L，硫 酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，氯化钙0.5 g/L， pH7.2； 各培养基灭菌的条件为:. 10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟； 二、 将蜡质芽孢杆菌发酵液40-70份;填料:轻质碳酸钙20-30份;紫外保护剂:抗坏血酸 1-2份，CMCO. 5-1份;干燥保护剂:蔗糖5-10份，甘露醇0.5-1份;混匀后喷雾干燥，得到蜡质 芽孢杆菌粉剂； 三、 将润湿剂:茶皂素2-5份;分散剂:Morwet D-4251-3份;芽孢萌发剂:肌苷0.1-0.5 份，丝氨酸0.2-1份混匀得到蜡质芽孢杆菌的助剂； 四、 将步骤二与步骤三所得到的蜡质芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉 碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于78%，润湿时间不高于70s， 水分含量低于5%，真空包装，即为蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂。
[0013] 其中，所述蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂最佳重量份组成为:蜡质芽孢杆菌发酵液60 份;填料:轻质碳酸钙22份;润湿剂:茶皂素3份;分散剂=Morwet D-425 2份;芽孢萌发剂： 肌苷0.3份，丝氨酸0.8份;紫外保护剂:抗坏血酸1份，CMCO. 8份;干燥保护剂:鹿糖6份，甘露 醇0.8份。
[0014] 自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为"萌发剂"，通 常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮 层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态， 接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。本发明可湿性粉剂 中含有芽孢萌发剂:肌苷，丝氨酸，是从苷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸， 苏氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨 酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸，肌苷，2,6吡啶二羧钙中进行单因素试验，及两两组合 性试验得到的具有明显诱导蜡质芽孢萌发的萌发剂。经过试验，本发明的蜡质芽孢杆菌可 湿性粉剂与水按1:100的比例进行润湿混合均匀，此时的芽孢萌发剂能充分与芽孢接触后， 从而促使其快速萌发，经过试验，30分钟后，芽孢萌发率已经达到85%以上，而未加芽孢萌发 剂的蜡质芽孢在4小时后，其芽孢萌发率只达到了55%左右。
[0015]本发明人通过对载体(如膨润土，滑石粉，高岭土，硅藻土，白炭黑，磷矿粉，轻质碳 酸钙）、助剂(润湿剂和分散剂）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na，吐温-60，十二烷基苯磺酸钠， T型木质素，十二烷基硫酸钠，茶皂素 ，Morwet EFW，Morwet D425，My100 ，D110，阿拉伯权胶， 2_萘磺酸甲醛聚合物钠盐，辛基酚聚氧乙烯醚，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠，甲基纤维素，木 质素磺酸钠），填料(硅藻土，高岭土，膨润土，白炭黑，轻质碳酸钙，滑石粉）、紫外线保护剂 (抗坏血酸，糊精，十二烷基苯磺酸钠，刚果红，羧甲基纤维素，卵磷脂），干燥保护剂(脱脂奶 粉，蔗糖，谷氨酸钠，麦芽糖，甘露糖，甲基纤维素等)进行筛选，其每种助剂对蜡质芽孢杆菌 的芽孢存活，悬浮性，湿润性进行试验，最后通过多轮单因素与正交试验确定蜡质芽孢杆菌 可湿性粉剂的配方。通过验证，本发明的蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂在20_25°C下保存一年， 其芽孢存活率还可达到89亿CFU/克。
[0016]本发明的可湿性粉剂采有真空包装，减少芽孢与空气的接触，降低了其萌发的机 率。
[0017]本发明的可湿性粉剂的水分含量低于5%，低水分含量的可湿性粉剂中即使含有芽 孢萌发剂(肌苷与丝氨酸），对其贮存过程中的芽孢活性也没有明显的影响，没有减少其在 贮存过程中的芽孢。
[0018] 本发明中的可湿性粉中含有丝氨酸等单分子氨基酸，不仅在使用初期作为萌发 剂，而施入大田后则作为氨基酸肥可起到肥效的作用。
[0019] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 这是国内首次将蜡质芽孢杆菌的芽孢萌发剂加入蜡质芽孢杆菌可湿剂进行工业化生 产，大大提升了芽孢萌发速率与萌发率，解决了因为芽孢萌发慢，萌发率