一种从大叶藻胚诱导体细胞胚的方法
【技术领域】
[0001]本发明所属植物组织培养研究领域，本发明涉及一种以大叶藻体胚为外植体的细胞胚的诱导方法。
【背景技术】
[0002]大叶藻(ZosteraL.)是我国北方沿海(山东、河北和辽宁)海草场的优势种，具有极其重要的生态服务功能和经济价值:它不仅是许多经济鱼类等海洋经济生物栖息、繁殖和藏身的良好场所，对这些海洋生物的幼体和卵起到保护作用，它还能形成众多的腐殖质，为浮游生物、幼小鱼虾等海洋动物提供了优良的天然饵料，如在胶东半岛和辽东半岛，大叶藻海草场是海参这种名优海产的最佳天然栖息地。
[0003]在近二十多年里，我国大叶藻海草场生态系统遭到了严重的破坏，面积急剧缩小，因此，近年来大叶藻海草场的修复已成为了我国北方海洋生态系统修复中不可或缺的一项内容，其草场修复中需要大量的种苗，利用植物组织培养技术在室内培养出无菌苗是缓解目前大叶藻修复移栽中种苗短缺的一个有效方法。
[0004]体细胞胚(又称胚状体)是植物组织培养中无菌苗再生的一个重要的中间环节，它的成功获得可为无菌苗再生奠定重要的基础。本发明以大叶藻的胚为外植体，通过组织培养技术诱导其体细胞胚，目前采用该技术方案的相关专利和文献未见报导。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，以大叶藻的胚为外植体，可有效地获得体细胞胚，为大叶藻的快速繁殖和无菌组培苗再生提供重要的技术支撑。
[0006]本发明所采用的技术方案为:
本发明的一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，是以大叶藻的胚为诱导体细胞胚的外植体。
[0007]本发明的具体步骤如下:
1、外植体的选取:采集大叶藻的果实或种子，清洗后在超净工作台内进行消毒处理，得到无菌果实或种子，剥去果皮或种皮，取出无菌胚；
2、体细胞胚的诱导培养:将无菌胚接种于培养基中，在15_25°C、黑暗或弱光条件下进行培养。每半月转接一次，60d后可见胚上有白色小突起出现，约75d后可确认为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。诱导培养基是盐度为20-35%。、且添加了有机添加物、碳源、植物激素的MS固体培养基。
[0008]本发明中，所采果实为近乎成熟的果实，种子为健康的成熟种子。
[0009]本发明中，优选培养基为MS培养基添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、PSK
0.001 mg/L、琼脂 5 g/L、海盐 20 g/L。
[0010]本发明中，优选培养条件为18-20°C、暗培养。
[0011]本发明的优点在于:大叶藻种子可长期保存，因此以其内的胚为外植体时，外植体的获取时间较长；且果实和种子易于表面消毒，因此表面消毒效果大大提升，获得无菌胚的比例也大大提高。本发明成功地从大叶藻胚上诱导出体细胞胚，为大叶藻无菌组培苗再生的实现提供了另一条可能途径，也为海草组织培养的成功奠定了基础。
【具体实施方式】
[0012]下面以最佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡依据本发明实施例所作的种种等效替换及修改，均属于本发明的发明精神及由权利要求所界定的专利范围内。
[0013]实施例:一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤包括:
1)外植体的选取:在大叶藻果实几近成熟时采集其健康佛焰苞花序，剥去佛焰苞花序外的苞叶，仅留里面的花序及其上的果实，清洗后在超净工作台内用15%的过氧化氢浸泡消毒20min，再用灭菌海水冲洗3-5次，得到无菌花序，逐个取下花序上的果实，切开果皮，取出无菌胚；
2)体细胞胚的诱导培养:在无菌条件下将无菌胚接种于诱导培养基，整个培养过程在18-20°C、黑暗条件下进行。每半月转接一次。诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、PSK 0.001 mg/L、琼脂5 g/L、海盐20 g/L。培养60d后可见胚上有白色小突起出现，约75d后可确认为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导率为15.58%。
【主权项】
1.一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其特征在于，是以大叶藻的胚为诱导体细胞胚的外植体。2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，步骤如下: 1)外植体的选取:采集大叶藻的果实或种子，清洗后在超净工作台内进行消毒处理，得到无菌果实或种子，剥去果皮或种皮，取出无菌胚作为外植体； 2)体细胞胚的诱导培养:将无菌胚接种于培养基中，在15-25°C、黑暗或弱光条件下进行培养，每半月转接一次，60d后可见胚上有白色小突起出现，约75d后可确认为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段；诱导培养基是盐度为20-35%。、且添加了有机添加物、碳源、植物激素的MS固体培养基。3.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，所采果实为近乎成熟的果实，种子为健康的成熟种子。4.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，优选培养基为MS培养基添加水解酪蛋白 500mg/L、蔗糖 60g/L、PSK 0.001 mg/L、琼脂 5 g/L、海盐 20 g/L。5.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，优选培养条件为18-20°C、黑暗培养。
【专利摘要】本发明涉及一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，是以大叶藻的胚为外植体，将无菌胚从果实或种子中剥出，接种到体细胞胚诱导培养基上，在15-25℃、黑暗或弱光照条件进行诱导培养，每半月转接一次，60天以后胚上产生小突起，形成体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基、并添加有机添加物、碳源、植物生长素和海盐的固体培养基。本发明的方法可不经历愈伤组织诱导培养阶段，在较短时间内从胚上直接诱导出大叶藻体细胞胚，为大叶藻无菌组培苗再生的实现和组培快速繁殖体系的建立提供了另一条可能途径，也为海草组织培养的成功奠定了基础。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105454042
【申请号】CN201410463126
【发明人】郑凤英, 李乐乐, 刘雪芹, 金艳梅, 张伟, 陈玉
【申请人】山东大学（威海）
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月12日