一种细胞冻存液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及组织细胞培养技术领域，具体设及一种细胞冻存液及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 神经干细胞(Neural stem Cell,NSC)是存在于胚胎或成体脑、脊髓等组织中的一 种干细胞，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞.可通过不对等的分裂方式分化 成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨 骼肌细胞。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不 同，分布也不同。虽然该细胞利用广泛，但要广泛地应用于临床治疗领域，其来源和数量仍 远远不能满足需求。因此神经干细胞的体外大规模扩增，W及将扩增后的细胞进行冷冻保 存，是本领域技术人员迫切的需求。
[0003] 细胞冻存的过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损 伤的危险。影响冻存效率的因素主要有:细胞浓度、冷冻速率W及冻存液。目前，神经干细胞 冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂 贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低溫保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基 亚讽(DMS0)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有径乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。 但是，DMS0会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的 神经干细胞，开展有效的神经干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低溫保 存神经干细胞的方法对于促进神经干细胞的研巧和应用具有重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种细胞冷冻保存液W及相应的制备方法及使 用方法。
[000引本发明的技术方案如下：
[0006] -种细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成:其特征是冷冻存液中含有： 二甲基亚讽8%w/v，淫羊蕾总黄酬30ng/ml，多肤1 %w/v，bFGFl %w/v，维生素 E1 %w/v，最后 用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肤的序列如SEQ ID NO: 1或2 所示。
[0007] 抗氧化抗冻肤沈Q ID N0:1:孤PAFVDKPPI犯化EHA;
[000引 抗氧化抗冻肤沈Q ID N0:2:NADRinTQFNSGPPLGP。
[0009] 在本发明的细胞的冻存液中，黄酬类物质W及维生素 E和多肤具有明确的抗氧化、 可W抵御自由基对细胞的损伤，特别是多肤，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的 损伤。
[0010] 本发明还提供了一种细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。
[0011] 本发明还提供了一种神经细胞冻存方法，包括W下步骤：
[0012] A.冻存液制备：制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分 按照相应的比例混合即可获得；
[0013] B.细胞悬液制备:培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.20 %膜蛋白酶液消化4分 钟，弃膜酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离屯、4000转/分，弃上清， 加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
[0014] C.冷冻:先将冻存管在4°C下冻存30min，然后放入-30°c冻存化，再放入-80°c冻存 3h，最后移入液氮中保存；
[001引D.细胞复苏:取出冻存管快速置于37°C水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用 5倍DMEM液稀释，10(K)r/min离屯、5min，离屯、去除上清液，再重复3次所述细胞悬浮浓度为108 细胞/na-i0w细胞/ml。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明的细胞冻存液，复苏细胞存活率可达99% W上，较使用常规细胞冻存液的 复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。
[0018] 本发明的干细胞冻存液可W长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞 生物学活性。
[0019] 本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值
【具体实施方式】
[0020] 实施例1细胞冻存液的制备
[0021 ] 将二甲基亚讽8 %w/v，淫羊蕾总黄酬30ng/ml，多肤1 %w/v，bFGFl %w/v，维生素 El %w/v，用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例溶解，定容至100ml，即得到所述的细胞 冻存液，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0022] 实施例2干细胞冻存液的制备
[0023] 将二甲基亚讽8 %w/v，淫羊蕾总黄酬30ng/ml，多肤1 %w/v，bFGFl %w/v，维生素 El %w/v，用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例溶解，定容至100ml，即得到所述的细胞 冻存液，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0024] 实施例3干细胞冻存液的制备
[0025] 将二甲基亚讽8 %w/v，淫羊蕾总黄酬30ng/ml，多肤1 %w/v，bFGFl %w/v，维生素 El %w/v，用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例溶解，定容至100ml，即得到所述的细胞 冻存液，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 1和2所示，二者等比例混合得到。
[0026] 比较例I
[0027] 分别量取70ml的MEM细胞培养液、20ml的小牛血清、lOml的二甲基亚讽，混合制得 常规细胞冻存液。
[0028] 实施例4冻存液的效果验证
[0029] W上实施例1-3及比较例I所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存 和复苏实验。
[0030] 细胞冻存过程：
[0031] 培养生长成单层的VER0、KMB17和神经干细胞细胞各9瓶，其细胞密度约6X 109个/ ml，加入抑7.0的PBS洗细胞表面一次。
[0032] 将细胞用0.20 %膜蛋白酶液消化4分钟，弃膜酶液，加入DMM培养液15ml，用吸管 轻轻吹打使细胞均匀，离屯、4000转/分，弃上清，加入实施例1-3和比较例1所制备的冻存液 2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
[0033] 冷冻：先将冻存管在4°C下冻存30min，然后放入30°C冻存化，再放入80°C冻存化， 最后移入液氮中保存;分别冻存1月，6个月，2年。没组3个重复。
[0034] 细胞复苏:取出冻存管快速置于37°C水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5 倍DMEM液稀释，100化/min离屯、5min，离屯、去除上清液，再重复3次，计算细胞存活率。结果如 下：
[0035]
[0037]取6个月的冻存细胞，进行细胞分化培养，其中所述的神经细胞能够正常进行分 化，分化效率达到90.7%，而比较例取出的细胞其分化率只能达到60.2%，说明细胞活性收 到很大的影响。
【主权项】
1. 一种细胞冻存液，其特征在于，其特征在于由如下各组分组成:其特征是冷冻存液中 含有:二甲基亚砜8%w/v，淫羊藿总黄酮30ng/ml，多肽l%w/v，bFGFl%w/v，维生素E1% w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。2. 权利要求1所述的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括混合所述配方比例的组 分，得到所述的冻存液。3. 权利要求1所述的细胞冻存液在提高冻存细胞复苏后存活率中的应用。4. 一种神经细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 冻存液制备:制备权利要求1所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各 组分按照相应的比例混合； B. 细胞悬液制备:培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.20 %胰蛋白酶液消化4分钟，弃 胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入 步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内： C. 冷冻:先将冻存管在4°C下冻存30min，然后放入-30°C冻存lh，再放入-80°C冻存3h， 最后移入液氮中保存； D. 细胞复苏：取出冻存管快速置于37°C水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍 DMEM液稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，再重复3次。所述细胞悬浮浓度为108细 胞细胞/ml。
【专利摘要】本发明提供了一种细胞冻存液及其制备方法。该细胞冻存液包括，二甲基亚砜8％w/v，淫羊藿总黄酮30ng/ml，多肽1％w/v，bFGF？1％w/v，维生素E？1％w/v。本发明提供的细胞冻存液用于冻存培养细胞，特别是提高了冻存细胞复苏后的存活率。并且本发明的冻存液具有价格适宜操作简便的优点适宜广泛利用。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105454222
【申请号】CN201610068837
【发明人】张云国, 耿晓波, 朱学义, 赵明宇, 王小龙, 张雪梅
【申请人】河南省银丰生物工程技术有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年2月2日