一种铁皮石斛离体快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种铁皮石斛试管内开花的方法。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛(学名:Dendrobiumofficinale Kimura et Migo),又名:黑节草、云南铁皮。属微子目，兰科多年生附生草本植物。铁皮石斛是我国传统中药，也是观赏价值很高的花卉。近年来，铁皮石斛产业发展迅猛，生产一直处于供不应求的状态。铁皮石斛在自然及栽培条件下开花周期较长，至少需要2年时间，离体开花结实技术不仅可以缩短育种年限，而且对于阐明成花机理及开发市场都具有重要意义。目前，已成功诱导离体开花的石斛属植物种类有细莖石斛心、金钗石斛、霍山石斛、Dendrobium Chao Praya Smile、Den_drobiumSonia 17和Dendrobium Madame Thong-1n等，有关铁皮石斛离体开花虽有报道，但花诱芽导率不高。
[0003]石斛具有较高的观赏价值和药用价值，是重要的贸易兰花种类。目前杂交育种是培育石斛遗传改良的重要手段，兰花育种周期长达2?3 a，如能缩短其育种周期，则可大大促进该产业的发展。当代，植物组织培养基本技术成熟，周期短、便于人工控制培养条件、繁殖速度快、占用空间小、经济效益高，是优良品种培育的有效途径。
【发明内容】
[0004]为解决目前铁皮石斛在自然及栽培条件下开花周期长的问题，本发明提供一种铁皮石斛试管内开花的方法。
[0005]本发明提供的铁皮石斛试管内开花的方法，包括如下步骤:
1)增殖培养:选取长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗，接种于增殖培养基中，常规培养至形成大量丛生芽，获得大量无菌铁皮石斛苗。
[0006]2)挑选步骤1)长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗，接种于生根培养基中，常规培养至长出白色的根。
[0007]3)开花培养:挑选步骤2)中根长0.5-1 cm的铁皮石斛苗，接种至花芽诱导培养基上，常规培养，直至开花。
[0008]其中，所述无菌苗优选长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗。
[0009]其中，所述增殖诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，外加植物调节剂。其中MS配方中所含蔗糖浓度为30 g/L，外加的萘乙酸浓度为0.1 mg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为3.0 mg/L。
[0010]其中，所述生根培养基以1/2 MS固体培养基为基本培养基，外加植物调节剂。其中所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.05 mg/L、活性炭浓度为1.0 mg/L。
[0011]其中，所述试管内开花培养基以MS固体培养基为基本培养基，外加植物调节剂。其中MS配方中所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.1 mg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为
3.5mg/L。
[0012]其中，所述常规培养的培养条件为pH值5.8，培养温度26 °C，光照周期12小时/天，光照强度为1000 lx。
[0013]其中，所述增殖培养的时间为30 d。
[0014]其中，所述生根培养的时间为7 d。
[0015]其中，所述试管内从形成花芽到开花直至凋谢共可维持60 d。
[0016]本发明还提供所述铁皮石斛试管内开花的方法在铁皮石斛繁育中的应用。
[0017]本发明的有益效果在于:
1)本发明可快速繁殖铁皮石斛无菌种苗。
[0018]2 )本发明采用离体快速繁殖技术对铁皮石斛进行试管内开花诱导，极大地解决了铁皮石斛自然及栽培条件下开花周期较长以及病虫害感染等诸多问题，能快速提供铁皮石斛种苗、缩短育种年限以适应市场的需求。
[0019]3)本发明在保护铁皮石斛自然资源、铁皮石斛优良品种和良好的生态环境等方面具有重要意义。
【附图说明】
[0020]以下是试管内铁皮石斛形成花苞、花苞半开放、花苞全开放、花苞凋谢以及试管铁皮石斛花卉的图片说明。
[0021]图1是培养30天后试管内铁皮石斛形成的花苞；
图2是培养35天后试管内铁皮石斛形成的半开放花苞；
图3是培养40天后试管内铁皮石斛形成的全开放花苞；
图4是培养60天后试管内铁皮石斛的凋谢的花。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0023]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用化学试剂均可市购。
[0024]实施例1
利用本发明进行铁皮石斛试管内开花诱导培养。
[0025]1)增殖诱导培养:挑选长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗接种至增殖培养基中进行常规诱导培养。所述铁皮石斛增殖诱导培养基为以MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.lmg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为3.0 mg/L的培养基，培养基pH值为5.8。(培养条件同步骤2)。培养30 d后，每株铁皮石斛苗能形成3棵左右的丛生芽，芽长1.5-2 cm。
[0026]2)生根诱导培养:挑选步骤1)中铁皮石斛丛生芽，接种至生根培养基中，进行常规诱导培养。所述铁皮石斛生根培养基为以1/2 MS固体培养基为基本培养基，所含鹿糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.05 mg/L、活性炭浓度为1.0 mg/L的培养基，培养基pH值为5.8。(培养条件同步骤2)。培养7 d后，形成大量0.5~1 cm的白色根须。
[0027]3)开花诱导培养:挑选步骤2)中根长0.5-1 cm的铁皮石斛苗，接种至花芽诱导培养基中，进行常规诱导培养。所述铁皮石斛开花培养基为以MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.1 mg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为3.5 mg/L的培养基，培养基pH值为5.8。(培养条件同步骤2)。培养30 d后即有花芽形成，直至开花、凋谢可维持60 d。(见附件1)
结果表明，无菌苗增殖倍数达4，生根率达100%，试管内开花率达75%、花期可维持30 d左右，能够得到保持母株优良性状的大量铁皮石斛种苗和试管开花植株。
[0028]实施例2
利用本发明进行铁皮石斛试管内开花培养。
[0029]所述增殖诱导培养基为以MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.1 mg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为3.0 mg/L的培养基，培养基pH值为5.8。其他条件同实施例1。
[0030]所述生根诱导培养基为以1/2 MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30g/L、萘乙酸浓度为0.05 mg/L、活性炭浓度为1.0 mg/L的培养基，培养基pH值为5.8，其他条件同实施例1。
[0031]所述开花诱导培养基为以MS固体培养基为基本培养基，所含鹿糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.1 mg/L,6-苄氨基嘌呤浓度为3.5 mg/L的培养基，培养基pH值为5.8，其他条件同实施例1。
[0032]结果表明，无菌苗增殖倍数达4，生根率达100%，试管内开花率达75%、花期可维持30 d左右，能够得到保持母株优良性状的大量铁皮石斛种苗和试管开花植株。
[0033]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种铁皮石斛试管内开花的方法，包括如下步骤: 1)增殖培养:选取长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗，接种于增殖培养基中，常规培养至分化出丛生芽，获得大量的铁皮石斛无菌苗； 2)生根培养:挑选步骤1)长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗，接种于生根培养基中，常规培养至长出白色的根； 3)开花培养:挑选步骤2)中根长0.5-1 cm的铁皮石斛苗，接种至花芽诱导培养基上，常规培养，直至开花。2.如权利要求1所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛无菌苗为长势旺盛、叶片翠绿及长势一致的铁皮石斛无菌苗。3.如权利要求2所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛增殖诱导培养基为以MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.1mg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为3.0 mg/L的培养基。4.如权利要求3所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛生根培养基为以1/2 MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.05mg/L、活性炭浓度为1 mg/L的培养基。5.如权利要求4所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛试管内开花培养基为以MS固体培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为30 g/L、萘乙酸浓度为0.1 mg/L、6-苄氨基嘌呤浓度为3.5 mg/L的培养基。6.如权利要求1-5所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述常规培养的培养条件为pH值5.8，培养温度26 V，光照周期12小时/天，光照强度为1000 lx。7.如权利要求6所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛增殖培养的时间为30 d左右。8.如权利要求7所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛生根培养的时间为7 d左右。9.如权利要求8所述的铁皮石斛试管内开花的方法，其特征在于，所述铁皮石斛试管内形成花芽的时间为30 d左右，直至花凋谢共可维持60 d。10.权利要求1-9任一项所述的铁皮石斛试管内开花的方法是在铁皮石斛繁育中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种铁皮石斛离体开花的方法，包括如下步骤：增殖培养、生根培养、开花培养和常规培养直至开花。本发明的方法外植体消毒效率高达90%，增值倍数达到4，无菌苗生根率达100%；正常花诱导率最高达84%，最低为25%，每株开l～3朵花不等。铁皮石斛试管离体开花技术极大地解决了铁皮石斛自然及栽培条件下开花周期较长以及病虫害感染等诸多问题，能快速提供铁皮石斛种苗、缩短育种年限以适应市场的需求。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105475128
【申请号】CN201410468593
【发明人】陈建荣, 刘芳, 唐映红, 郭清泉
【申请人】长沙学院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月16日