一种山豆根毛状根的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物生物技术方法，特别是一种山豆根毛状根的快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]山豆根，也称广豆根、南豆根，为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensisGapnep.)的干燥根及根茎，分布于我国南部，以广西产量最大。具有清火解毒、消肿止痛等功效，可以治疗喉痈、喉风、喉痹、牙龈肿痛、喘满热咳、肝炎、便秘、黄疸、下痢、痔疾、秃疮、疥癣及蚊、虫、犬咬伤等。医药工业用山豆根作为原料，大量研制开发治疗肝炎的针剂、咽喉肿痛的片剂以及抗肿瘤的中成药，同时工业上也用于提取苦参碱、氧化苦参碱等成分，广泛应用于制药和植物源农药的生产。
[0003]山豆根生长缓慢，分布零星。由于用药量的增加以及使用途径的拓展，山豆根的市场需求量不断增大，药材的价格也不断上涨，从而导致山豆根资源的无节制采挖，野生资源濒临枯竭。毛状根因具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物等特点，是生产药用植物次生代谢产物的立项载体。为了缓解野生资源的压力，减少野生资源的使用，许多企业开始利用毛状根发酵的途径来生产工业用次生代谢产物的替代资源。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种山豆根毛状根的快速繁殖方法，它能够快速的繁殖山豆根毛状根，以供后续大规模培养生产工业用山豆根的替代资源。
[0005]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种山豆根毛状根的快速繁殖方法，包括以下步骤:
[0006](I)无菌苗的获得:取山豆根种子置于0.1￥八％升汞消毒lOmin，再用无菌水冲洗3次，并用消毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的1/2MS培养基中，放置在培养室内进行萌发，获得山豆根无菌苗子叶，其中MS培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的琼脂，培养基的pH值为5.8;
[0007](2)R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根:将山豆根的无菌苗子叶放入R1601菌液中浸泡16min取出，以无菌水为对照，然后用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液，转移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固体培养基上培养3d获得毛状根，处理30瓶，每瓶I个无菌子叶。当诱导出的根长至约2cm时，在无菌条件下将其剪下，于含有头孢噻肟钠300m/L的1/2MS固体平板培养基上进行除菌培养，每5d转接I次，直至无菌，获得无菌毛状根。
[0008](3)山豆根毛状根繁殖:将步骤(2)所得到的毛状根分株置于1/2MS培养液中进行快速繁殖，培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的，其中1/2MS繁殖培养液中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1-1.0mg/L的苄基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8。
[0009]本发明的突出优点在于:
[0010](I)采用本方法进行山豆根毛状根繁殖，具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物等特点，繁殖倍数达到39-55倍，是生产次生代谢产物理想的载体。
[0011](2)本方法获得的毛状根易于进行大量繁殖培养，能够进行大规模生产以作为工业用山豆根的替代资源来提取苦参碱、氧化苦参碱等次生代谢产物，满足工业需要，具有重大应用前景。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0013]实施例1
[0014]本发明所述山豆根毛状根的快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤:
[0015](I)无菌苗的获得:取山豆根种子置于0.1?八％升汞消毒lOmin，再用无菌水冲洗3次，并用消毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的1/2MS培养基中，放置在培养室内进行萌发，获得山豆根无菌苗，其中MS培养基中添加30g//L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8;
[0016](2)R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根:将山豆根的无菌苗子叶放入R1601菌液中浸泡16min取出，以无菌水为对照，然后用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液，转移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固体培养基上培养3d获得毛状根，处理30瓶，每瓶I个无菌子叶。当诱导出的根长至约2cm时，在无菌条件下将其剪下，于含有头孢噻肟钠300m/L的1/2MS固体平板培养基上进行除菌培养，每5d转接I次，直至无菌，获得无菌毛状根。
[0017](3)山豆根毛状根繁殖:将步骤(2)所得到的毛状根分株置于1/2MS培养液中进行快速繁殖，培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的，其中1/2MS繁殖培养液中含0.lmg/L的吲哚乙酸IAA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、0.lmg/L的苄基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8，毛状根的繁殖倍数为39倍。
[0018]实施例2
[0019]本发明所述山豆根毛状根的快速繁殖方法的另一个实例，包括以下步骤:
[0020](I)无菌苗的获得:取山豆根种子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用无菌水冲洗3次，并用消毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的1/2MS培养基中，放置在培养室内进行萌发，获得山豆根无菌苗子叶，其中MS培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的琼脂，培养基的pH值为5.8;
[0021](2)R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根:将山豆根的无菌苗子叶放入R1601菌液中浸泡16min取出，以无菌水为对照，然后用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液，转移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固体培养基上培养3d获得毛状根，处理30瓶，每瓶I个无菌子叶。当诱导出的根长至约2cm时，在无菌条件下将其剪下，于含有头孢噻肟钠300m/L的1/2MS固体平板培养基上进行除菌培养，每5d转接I次，直至无菌，获得无菌毛状根；
[0022](3)山豆根毛状根繁殖:将步骤(2)所得到的毛状根分株置于1/2MS培养液中进行快速繁殖，培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的，其中1/2MS繁殖培养液中含0.8mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的苄基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8，毛状根的繁殖倍数为55倍。
[0023]实施例3
[0024]本发明所述山豆根毛状根的快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤:
[0025](I)无菌苗的获得:取山豆根种子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用无菌水冲洗3次，并用消毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的1/2MS培养基中，放置在培养室内进行萌发，获得山豆根无菌苗子叶，其中MS培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的琼脂，培养基的pH值为5.8;
[0026](2)R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根:将山豆根的无菌苗子叶放入R1601菌液中浸泡16min取出，以无菌水为对照，然后用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液，转移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固体培养基上培养3d获得毛状根，处理30瓶，每瓶I个无菌子叶。当诱导出的根长至约2cm时，在无菌条件下将其剪下，于含有头孢噻肟钠300m/L的1/2MS固体平板培养基上进行除菌培养，每5d转接I次，直至无菌，获得无菌毛状根；
[0027](3)山豆根毛状根繁殖:将步骤(2)所得到的毛状根分株置于1/2MS培养液中进行快速繁殖，培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的，其中1/2MS繁殖培养液中含0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的苄基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8，毛状根的繁殖倍数为45倍。
[0028]实施例4
[0029]本发明所述山豆根毛状根的快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤:
[0030](I)无菌苗的获得:取山豆根种子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用无菌水冲洗3次，并用消毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的1/2MS培养基中，放置在培养室内进行萌发，获得山豆根无菌苗子叶，其中MS培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的琼脂，培养基的pH值为5.8;
[0031](2)R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根:将山豆根的无菌苗子叶放入R1601菌液中浸泡16min取出，以无菌水为对照，然后用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液，转移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固体培养基上培养3d获得毛状根，处理30瓶，每瓶I个无菌子叶。当诱导出的根长至约2cm时，在无菌条件下将其剪下，于含有头孢噻肟钠300m/L的1/2MS固体平板培养基上进行除菌培养，每5d转接I次，直至无菌，获得无菌毛状根；
[0032](3)山豆根毛状根繁殖:将步骤(2)所得到的毛状根分株置于1/2MS培养液中进行快速繁殖，培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的，其中1/2MS繁殖培养液中含1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、1.0mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的苄基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8，毛状根的繁殖倍数为46倍。
【主权项】
1.一种山豆根毛状根的快速繁殖方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)无菌苗的获得:取山豆根种子置于0.1￥八％升汞消毒lOmin，再用无菌水冲洗3次，并用消毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的1/2MS培养基中，放置在培养室内进行萌发，获得山豆根无菌苗子叶，其中MS培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的PH值为5.8; (2)R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根:将山豆根的无菌苗子叶放入R1601菌液中浸泡16min取出，以无菌水为对照，然后用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液，转移至添加乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固体培养基上培养3d获得毛状根，处理30瓶，每瓶I个无菌子叶，当诱导出的根长至约2cm时，在无菌条件下将其剪下，于添加头孢噻肟钠300m/L的1/2MS固体平板培养基上进行除菌培养，每5d转接I次，直至无菌，获得无菌毛状根； (3)山豆根毛状根繁殖:将步骤(2)所得到的毛状根分株置于1/2MS繁殖培养液中进行快速繁殖，培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10小时/天的，其中1/2MS繁殖培养液中添加0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸ΙΑΑ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的苄基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8。
【专利摘要】一种山豆根毛状根的快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取山豆根种子进行消毒后接种到1/2MS培养基中萌发，获得山豆根无菌苗；(2)用R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根；(3)将步骤(2)所得到的毛状根分株置于培养液中进行快速繁殖培养，繁殖倍数达到39-55倍，通过本发明所获得的山豆根毛状根具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物的特点，能够用于大规模生产生产工业用山豆根的替代资源。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105494090
【申请号】CN201510862709
【发明人】李林轩, 韦坤华, 韦范, 缪剑华, 李翠, 韦莹, 王一诺, 肖东
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月30日