一种富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法。
【背景技术】
[0002]金花茶是一种富含次生代谢物质的药用木本花卉，其中，儿茶素是一类具有抗氧化、抗炎与抑制克氏锥虫生长等作用的酚类物质。目前对于金花茶儿茶素等药用物质的开发主要集中在活体植物上，其开发过程对外界环境要求较高且会对作为国家一级保护植物的金花茶的生存造成影响。
[0003]组织培养技术以离体材料作为初始材料，对初始材料的量要求较小，对活体植物几乎无影响，且更容易应用于大规模生产。因此，利用组织培养技术，以离体材料进行大规模儿茶素生产极为重要。遗憾的是，迄今为止尚无此类报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其以金花茶幼嫩茎段为材料、以植物组织培养为基础进行金花茶愈伤组织的培养，所获得的愈伤组织中儿茶素种类丰富且含量高，可应用于离体生产金花茶儿茶素。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其包括金花茶体细胞胚培养、金花茶愈伤组织诱导、金花茶愈伤组织增殖培养3个步骤，具体操作如下:
1)金花茶体细胞胚的培养:以金花茶成年植株的幼嫩茎段为材料，以MS+2.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为诱导培养基诱导体细胞胚，80 d后将诱导出来的体细胞胚接种到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的培养基上，于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗条件下以周期为30 d进行继代培养；
2)金花茶愈伤组织的诱导:以MS+0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为组织诱导培养基，将继代培养的金花茶体细胞胚切块，于25±2 °C、黑暗条件下进行培养，30d后得到愈伤组织；
3)金花茶愈伤组织的增殖培养:以MS+4.0mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4_D为增殖培养基，以30 d为培养周期，将诱导出的金花茶愈伤组织于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗条件下进行继代培养。
[0006]各培养基在高压灭菌前调pH值为5.8;所述高压灭菌的温度为121°C，灭菌时间为
20 mino
[0007]本发明的优点在于:本发明以金花茶幼嫩茎段为材料、以植物组织培养为基础进行金花茶愈伤组织的培养，有生长速度快、条件可控且不依赖于外界环境等特点，同时，按本发明方法进行处理，不会对金花茶的活体植株造成伤害，且在成功诱导愈伤组织后可进行大规模培养，具有规模化效应，所获得的愈伤组织中儿茶素种类丰富且含量高，可应用于离体生产金花茶儿茶素。
【附图说明】
[0008]图1为金花茶体细胞胚的培养情况示意图。
[0009]图2为金花茶愈伤组织的诱导情况示意图。
[0010]图3为金花茶愈伤组织的增殖情况示意图。
[0011]图4为儿茶素类物质测定的高效液相色谱图，其中(A)为(+ )_儿茶素标准品，(B)为金花茶愈伤组织干粉提取液。
【具体实施方式】
[0012]为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0013]1、金花茶体细胞胚的培养
在晴天中午取无病、健壮的金花茶成年树的未木质化的幼嫩茎段，先于流水下冲洗30min清除表面灰尘，然后在紫外消毒后的超净工作台上按75%酒精30 s，0.1%升汞3 min，无菌水I次，0.1%升汞9 min，无菌水4次的程序对外植体进行消毒，切除在消毒过程中的裸露伤口；然后将长约I cm左右的金花茶幼嫩茎段接种到MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30g/L蔗糖+6 g/L琼脂的诱导培养上，80 d后将诱导出来的体细胞胚接种到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的培养基上，培养基在高压灭菌(121 °C,20 min)前调节pH值为
5.8，于培养光环境为:12 h光照+12 h黑暗、培养温度为25±2 °C的条件下以周期为30 d进行继代培养，得到生长旺盛的金花茶体细胞胚(如图1);
2、金花茶愈伤组织的诱导
在紫外消毒后的超净工作台上将生长旺盛呈亮黄色的金花茶体细胞胚切成约0.5 cm3的方块，并将与培养基接触的一侧表皮切除，然后接种到MS+ 0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的组织诱导培养基上，培养基在高压灭菌(121 °C，20min)前调节pH值为5.8，于培养光环境为黑暗、培养温度为25±2 °C的条件下培养30d，即可从金花茶体细胞胚切块上诱导出愈伤组织(如图2);
3、金花茶愈伤组织的增殖培养
在紫外消毒后的超净工作台上小心地将诱导出的愈伤组织与体细胞胚切割分离，切割时尽量不损伤愈伤组织，以减少损伤引起的褐化，然后将愈伤组织接种到MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4-D的增殖培养基上，培养基在高压灭菌(121 °C，20 min)前调节pH值为5.8，于培养光环境为:12 h光照+12 h黑暗、培养温度为25±2 °C的条件下以周期为30d进行继代培养(如图3)。
[0014]所得愈伤组织增殖系数(愈伤组织增殖系数=培养30d后的鲜重/接入的鲜重)可达3.19?3.55。
[0015]采用香荚兰素法测定儿茶素含量，具体是将所得金花茶愈伤组织干燥后磨碎并过20目筛，然后取0.5 g干粉，加95%乙醇20 mL，90°C水浴提取30 min，使乙醇保持微沸;过滤后冷却，用95%乙醇定容至25 mL;吸取试液320yL，注入盛有700yL 95%乙醇的10 mL离心管中，摇匀，得金花茶愈伤组织干粉提取液;另将于秋季在金花茶成年植株上采摘的叶片按相同方法进行处理，得金花茶叶片组织干粉提取液。然后分别在两个提取液中加入1%香荚蓝素盐酸溶液5 mL，盖上盖子摇匀显红色;放置40分钟后，以试剂空白作参比，用5 mm比色皿于波长500 nm处比色测定吸光度。结果显示，金花茶叶片组织干粉提取液中儿茶素的含量仅为4.37-4.53 mg/g(干重)，而金花茶愈伤组织干粉提取液中儿茶素含量为27.25-28.66 mg/g(干重)。
[0016]采用高效液相色谱对所得金花茶愈伤组织干粉提取液中的儿茶素物质进行检测，高效液相条件为:以日立高效液相仪为检测仪器，以水:乙腈:甲醇(83:6:11)为流动相，流速为1.0 mL/min，以C-18为固定相，柱温为25°C，检测波长为280 nm，进样量为40yL，每个样品检测40 min。结果如图4显示，金花茶愈伤组织干粉提取液中含有(+)-儿茶素且可能含有七种其他类型的儿茶素。
[0017]由此可见，采用本发明方法所获得的愈伤组织中儿茶素种类丰富且含量高，可应用于离体生产金花茶儿茶素。
[0018]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其特征在于:包括金花茶体细胞胚培养、金花茶愈伤组织诱导、金花茶愈伤组织增殖培养3个步骤。2.如权利要求1所述富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其特征在于:所述金花茶体细胞胚培养的方法为:以金花茶成年植株的幼嫩茎段为材料，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为诱导培养基诱导体细胞胚，80 d后将诱导出来的体细胞胚接种到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的培养基上，于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗条件下以周期为30 d进行继代培养。3.如权利要求1所述富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其特征在于:所述金花茶愈伤组织诱导的方法为:以MS+0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为组织诱导培养基，将继代培养的金花茶体细胞胚切块，于25 ±2 °C、黑暗条件下进行培养，30d后得到愈伤组织。4.如权利要求1所述富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其特征在于:所述金花茶愈伤组织增殖培养的方法为:以MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4_D为增殖培养基，以30 d为培养周期，将诱导出的金花茶愈伤组织于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗条件下进行继代培养。5.如权利要求2-4所述富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，其特征在于:各培养基在高压灭菌前调pH值为5.8; 所述高压灭菌的温度为121°C，灭菌时间为20 min。
【专利摘要】本发明公开了一种富含儿茶素的金花茶愈伤组织的获取方法，属于植物组织培养技术领域，其包括金花茶体细胞胚培养、金花茶愈伤组织诱导、金花茶愈伤组织增殖培养3个步骤。本发明以金花茶幼嫩茎段为材料、以植物组织培养为基础进行金花茶愈伤组织的培养，其具有生长速度快、条件可控且不依赖于外界环境等特点，具有规模化效应，且获得的愈伤组织中儿茶素种类丰富且含量高，可应用于离体生产金花茶儿茶素。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105532460
【申请号】CN201610007591
【发明人】钟春水, 赖钟雄, 程春振, 陈裕坤, 林玉玲, 刘生财, 张梓浩
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月7日