蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基及脱毒育苗方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于植物组培脱毒育苗技术，具体是涉及一种以蓝莓茎尖为外植体，干燥 结合冷冻脱毒组培育苗培养基以及脱毒育苗方法。
【背景技术】
[0002] 蓝莓原产北美，属于杜鹊花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)为多年生落 叶或常绿灌木，果实富含花色苷等抗氧化物质，具有改善视力、抗氧化、抗癌及延缓脑神经 衰老等保健功能，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一，同时也被誉为"衆果之王"。
[0003] 我国蓝莓引种栽培研究始于20世纪末，近年来栽培面积正快速增加，但果农对病 毒病害的发生发展缺乏认知和防治经验，从而存在病毒病害快速传播而后严重暴发的巨大 潜在危险。蓝莓病毒病害常引起叶片褪绿、畸形、脱落、黄化或斑驳，花瓣变红或枯萎，茎部 畸形弯曲、表皮形成红色条纹或发生顶梢枯死，树体矮化、减产或死亡等症状，严重时减产， 甚至绝产。目前，已发现10余种侵染蓝莓的病毒，尤其以蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BIShV)、蓝莓鞋带病毒（Blueberry shoestring virus，BBSSV)、蓝莓枯萎病毒 (Blueberry scorch virus，BLSCV)等危害为主。其中，蓝莓休克病毒为目前危害蓝莓最严 重的病毒之一。BIShV病毒可通过蜜蜂携带感染的花粉传播，几乎侵染所有的蓝莓品种，并 表现相似的症状。据统计，BIShV侵染蓝莓造成的损失可高达34%~90%。截止目前，还没有 任何针对病毒病的有效药物，只以预防为主，其中无病毒种苗培育为最关键的措施之一。 [0004]为避免病毒给生产带来的巨大危害，实现蓝莓的无病毒苗栽培是目前我国蓝莓产 业快速发展的必经之路。目前，无病毒苗主要通过热处理脱毒法、茎尖脱毒法、花药培养法、 微茎尖嫁接脱毒法、愈伤组织培养法和抗病毒剂法等生物技术方法获取，其中热处理结合 茎尖脱毒法运用最为广泛，然而此法与新兴的茎尖低温结合超低温脱毒法相比，仍存在操 作难度大、耗时长以及脱毒率偏低等明显缺点。茎尖超低温脱毒法是一种新型高效脱除植 物病毒的新技术，已在马铃薯、柑桔、葡萄、樱桃、草莓、甘薯等植物上进行研究并取得了一 定成果，被认为是目前最有效脱除植物病毒的方法之一，冷冻脱毒法中分为快速冷冻法、慢 速冷冻法、分步冷冻法、干燥冷冻法等，其中快速冷冻法、慢速冷冻法需要昂贵精密的培养 箱，且对梯度温度控制难度较大，干燥冷冻法仅需采用干燥器控制材料脱水速度和脱水程 度，操作简便，周期短。
[0005] 经检索，尚未发现有关蓝莓组培苗脱毒方面的资料报道。因此，研发蓝莓茎尖干燥 冷冻脱毒组培育苗技术，不但为蓝莓，还为木本果树组培脱毒育苗开劈了一条新途径或借 鉴之路。
【发明内容】
[0006] 针对蓝莓的经济价值越来越被人们认识，发展蓝莓生产的热情高涨，依靠传统的 扦插育苗和组培育苗，从数量和质量上均无法满足现实生产的需求，为此，本发明要解决的 技术问题是提供一种以蓝莓茎尖为外植体，干燥冷冻组培脱毒育苗培养基及脱毒育苗方 法。
[0007] 本发明的技术问题通过如下技术方案解决：
[0008] 本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基，包括不同诱导时期的五种培养基，各 种培养基的原料及其附加量分别是：
[0009] (1)超低温预培养基:WPM培养基+20ml · L-1甘油+136.8g · L-1蔗糖，PH5.2;
[0010] (2)超低温培养基:WPM培养基+300ml · L-1 甘油+150ml · L-1 乙二醇+150ml · L-1 二 甲基亚楓即DMS0+136.8g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0011] (3)恢复培养基:WPM培养基+0.1mg · L-1玉米素即ZT+0.1mg · L-萘乙酸即ΝΑΑ+ O.lmg · L-1 赤霉素即GA3+8.0g · L-1 琼脂粉+30g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0012] (4)芽增殖诱导培养基:WPM培养基+0.5mg · L-hT+O.lmg · L-SAA+O.lmg · L-1GA3+ 8 · Og · L-1 琼脂粉+30g · L-1 鹿糖，pH5 · 2;
[0013] (5)生根壮苗培养基:WPM培养基+0.1mg · L-SAA+S.Og · L-1琼脂粉+30g · L-1蔗糖， pH5.2〇
[0014] 用上述的培养基进行蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗方法经过下列步骤：
[0015] (1)蓝莓茎尖干燥培养:选取组培继代培养40 ± 2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为 0.5~1.0cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于 室温下干燥脱除鲜重重量10 %~30 %的水分；
[0016] (2)茎尖分离剥取及超低温培养:在体视显微镜下剥取经干燥脱水处理的顶芽茎 尖，茎尖长为1 .〇~1.5_，置于1.8ml冷冻管中，每管置10个茎尖，加入超低温预培养基2~ 5ml，在0°C条件下处理10~70min，用无菌枪头吸出超低温预培养基，加入2ml超低温培养 基，并将冷冻管置于〇°C冰水混合物中处理60min，将冷冻管放入自制纱布袋中，迅速投入液 氮中，保存60~120min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立即进行40°C水浴化冻处理0.2~ 1.5min，再送入0°C冰水混合物中处理10min;将茎尖用WPM培养基+410.4g · I/1蔗糖溶液清 洗3次，每次10min，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面的液体，待接种到恢复 培养基；
[0017] ⑶恢复培养:为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将超低温培养的茎尖接种 至恢复培养基中先在〇°C条件下暗培养5~7d(这更有利于蓝莓茎尖离体材料恢复生长），再 转移至光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养30d，培养温度为25±2°C;
[0018] (4)病毒检测：将以上通过干燥冷冻培养获得的试管离体材料通过RT-PCR反转录 病毒检测，经检测确认不带病毒，即为蓝莓脱毒种苗；
[0019] (5)芽诱导增殖培养:病毒检测后确定脱毒的成活茎尖转接至芽增殖诱导培养基 中培养增殖出不定芽;微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/ 暗8h，光照强度为40~50ym 〇l m-2s-1，培养温度为25 ± 2°C;
[0020] (6)生根培养:将步骤(5)所述的不定芽在生根壮苗培养基中诱导生根，培养30~ 45d，生根率达95%，光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为30~40μπι 〇1 πΓ2。，培 养温度为25±2°C。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 应用本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒法培育蓝莓脱毒组培苗，操作简便，无需昂贵 精密的仪器设备，成本低，周期短，同时，再生植株能较好地保持母本的优良性状，长势强、 遗传稳定性好，苗木健壮、有良好的抗逆性。与常规茎尖脱毒相比，本方法还具有成活率高、 脱毒效率尚等显者优点。
[0023]以蓝莓茎尖结合冷冻干燥脱除BIShV病毒为例，经对比试验，将脱毒芽增殖并进行 RT-PCR病毒检测，其成活率为78.3 %，脱毒率高达95.7 %。
【附图说明】
[0024]附图为蓝莓脱毒种苗RT-PCR扩增结果凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明下面结合实施例作进一步详述:本蓝莓茎尖冷冻干燥组培脱毒方法，首先 是选取组培继代培养40 ± 2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为0.5~1.0cm的顶芽，置于无菌培 养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于室温下干燥脱除鲜重的10%~ 30 %水分后在体视显微镜下剥取长为1.0~1.5mm的顶芽莖尖，置于1.8ml冷冻管中，每管置 10个莖尖，加入超低温预培养基2~5ml，在0°C条件下处理10~70min，用无菌枪头吸出超低 温预培养基，加入2ml超低温培养基，并将冷冻管置于0°C冰水混合物中处理60min，将冷冻 管放入自制纱布袋中，迅速投入液氮中，保存60~120min后，从液氮中迅速取出冷冻管，立 即进行40°C水浴化冻处理0.2~1.5min，再送入0°C冰水混合物中处理lOmin;将茎尖用WPM 培养基+410.4g · Γ1蔗糖溶液清洗3次，每次lOmin，取出茎尖置于无菌滤纸上以吸去残留在 茎尖表面的液体，接种到恢复培养基中培养35d后进行病毒检测，将经检测确认不带病毒的 蓝莓脱毒种苗进行芽诱导增殖及生根培养。本实验是在每组重复3次，每种基本培养基有20 个外植体的对比试验得出的，经该干燥冷冻方法脱毒的茎尖，成活率、脱毒率高，再生苗健 壮。
[0026] 本发明所公开的五种在特定阶段配合应用的培养基及各相关参数、条件如温度、 凝固剂等也可用诸如葡萄糖、水晶洋菜等替代，培养基各原料的配比值也可分别采用本发 明最佳方案定值的接近值取代。
[0027] 下面给出的是本发明的最佳实施例。
[0028] 本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基，包括不同诱导时期的五种培养基，各 种培养基的原料及其附加量分别是：
[0029] (1)超低温预培养基:WPM培养基+20ml · L-1甘油+136.8g · L-1蔗糖，pH5.2;
[0030] (2)超低温培养基:WPM培养基+300ml · L-1 甘油+150ml · L-1 乙二醇+150ml · L-1 二 甲基亚楓即DMS0+136.8g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0031] (3)恢复培养基:WPM培养基+0.1mg · L-1玉米素即ZT+O.lmg · L-萘乙酸即ΝΑΑ+ O.lmg · L-1 赤霉素即GA3+8.0g · L-1 琼脂粉+30g · L-1 蔗糖，ρΗ5·2;
[0032] (4)芽增殖诱导培养基:WPM培养基+0.5mg · L-tT+O. lmg · L-SAA+O. lmg · L- 8 · Og · L-1 琼脂粉+30g · L-1 鹿糖，pH5 · 2;
[0033] (5)生根壮苗培养基:WPM培养基+0· lmg · L-SAA+S.Og · L-1琼脂粉+30g · L-1蔗糖， pH5.2〇
[0034] 应用本蓝莓茎尖干燥冷冻组培脱毒育苗培养基进行组培脱毒育苗方法，经过下列 步骤：
[0035] (1)蓝莓茎尖干燥培养:选取组培继代培养40 ± 2d的蓝莓无菌苗形态学上端长为 0.5~1.0cm的顶芽，置于无菌培养皿中，加盖，但不密封，将该培养皿置于真空干燥器中，于 室